念珠菌快速诊断的实验研究

真诚永远

                                                                                                            山东省德州市人民医院     薛万华
       【摘 要】目的  快速诊断念珠菌性感染疾病。方法  采用番茄琼脂玻片培养法与常规培养法对100例临床标本进行分析比较。结果  番茄琼脂玻片培养法可在6- 13h发出诊断报告，并能鉴定到属，且与常规培养法阳性符合率达到100%。结论  本法具有快速准确、经济实用，易推广等特点，是念珠菌性感染疾病早期诊断、治疗、预防和监控的好方法。
       【关键词】 念珠菌菌细胞集团快速诊断

       近年来临床上念珠菌诱发生殖器病变的显著增多，快速准确的细菌学诊断念殊菌性感染具有重要意义。我们试用玻片培养法，在低倍显微镜下通过观察念珠菌繁殖期的菌细胞集团或微小菌落边缘细胞的特殊形态，以达到快速诊断目的，通过菌种实验和临床标本使用获得满意的结果，现介绍如下。
1 材料和方法
       1.1培养基选择与制作:①番茄琼脂碟[2]按常规制备。②番茄琼脂玻片制备:将制备好的培养基溶化以无菌手续加至2.5cmx 7 .5cm 无菌载玻片置中部，每张玻片约加1.5~2.0 ml，玻片两端约有1.5cm保持无培养基存在，以便倒置存放和培养时避免污染，制备后冰箱中可存放3~5d。
       1.2 菌种试验及观察方法:
       1.2.1 实验菌株与对照菌株①实验菌:念珠菌类5株A: 8417-白色念珠菌(北医大);B: 8901-热带念珠菌(北医大);C: 2000264-白色念珠菌(本科室);D:95693-近平滑念珠菌(本科室);E:95716-高里氏念珠菌(本科室)。②对照菌株:新型隐球菌2株;F:9921-新型隐球菌(省质控);G:11340-新型隐球菌(北医大);H: ATCC 25923-金黄色葡萄球菌(标准菌);I:9832-洋葱假单胞(省质控);J:9625-大肠埃希氏菌(省质控)。
       1.2.2 菌种实验将菌种混悬于无菌生理盐水中，使每毫升含5亿菌，用同1菌环各取一环按三区划线分别分离到番茄玻片上，倒置湿盒中35℃培养，分别在培养前，培养后1,2,3,4,5,6,8,10,13h对菌细胞繁殖期的生长速度进行观察。
       1.2.3 繁殖期菌细胞的观察将培养物置于10x10倍显微镜下观察原划区，①阴性:原划线区无念珠菌菌细胞繁殖的菌细胞集团。②阳性:原划线区可见无色，有单个圆形或椭圆形菌细胞繁殖集团，每个菌细胞凝团可含20~40个单个菌细胞，且有芽生现象。细胞量随繁殖时间延长而增多，念珠菌细胞集团当单细胞减少时，单细胞间较疏远，随培养时间延长，不断缩小细胞间的距离，直至微小菌落的形成，按念珠菌的细胞集团数量以(+)到(++++)报告，此期培养时间在6~13h内。
       1.2.4 微小菌落期的观察念珠菌菌落呈灰白、凸起、浑浊、显微镜下菌落中心因菌落细胞重叠，不透光无法观察，观察菌落周围可获满意结果，菌落边缘能十分容易见到圆形或椭圆形(有的念珠菌型的菌细胞呈花枝状、丝状)众多念珠菌细胞，且有芽生现象，极易诊断。
2 结果
       通过分析发现念珠菌1~2h开始增殖，单细胞体大呈圆或椭圆形(热带念珠菌呈花枝状)，且有芽生现象，如白色念珠菌为2.5~4.5 um，易于与其他各生长菌区别，详见表1。

       100 例阳性标本琼脂玻片培养法6h培养与常规法培养比较，结果二者的阳性符合率达到72%(这可能与用药治疗后有关);本法培养延长至13h,则两法的阳性符合率达到100%。13h培养为最佳培养时间，适合于临床诊断的要求，达到了预期目的。
       从临床上选取50份高度疑为念珠菌感染随机标本进行直接涂片法与本法6~13h结果比较，直接涂片法假阳姓率为20%，假阴性率16%:故直接涂片法不适合临床诊断的要求。本方法可在6~13h发出诊断报告，并能鉴定到属，且与常规培养法阳性符合率达100%，准确性高，避免了直接涂片法的假阳性或假阴性结果，具有快速、准确、经济实用，适用于临床，易推广等特点，是念珠菌性感染诊断学的有益补充。
3 讨论
       1995年前念殊菌引起的性感染病例我区很少见，龙其男性患者未曾发现，1996年~1997年逐渐增多，到2000年9月1000余例临床随机标本应用玻片培养法6~13h观察结果，培养总阳性率约为30%。以往靠直接涂片确诊本病，此法简单、易行，但受人员素质、取材方式及标本中的血细胞影响，结果不稳定，尤其不适宜男性患者标本。常规培养是准确可靠的方法但需2~3d时间。即使用番茄琼脂培养出可检菌落也需23h。因此，创立一种简易、快捷、经济的诊断方法十分必要。在培养基研究方面，比利时F.CODDS等在沙氏中加人产色剂，我国高屹在沙氏中加人TTC[7]，朱江等在WCG中加人TTC[8]，美国冯贻泽等在YM固体中加人0.1AnlineBNUE。以上是原有某一种培养基为基础加入指示剂类，通过生长菌产生颜色或放出荧光判断是哪一种念珠菌。以上均为观察菌落形成后颜色或荧光才能初步诊断。念珠菌繁殖速度快，单菌细胞体大，有芽生的特点，完全可以通过观察培养繁殖期间念珠菌菌细胞的形态特点，以达到快速诊断的需求。
       临床实用时，标本接种后可直接镜检，如果标本中念珠菌类菌量多，且有典型的念珠菌形态亦可发出初步报告，到6~13h再观察，发出最终报告。标本接种时接种量易大且行三段划线，6h选原划线区观察。13h的选细小菌苔或菌落观察，念珠菌经繁殖后因其有独特的特点很易确认。在标本中若有微球菌或G-b同时生长，6h后重叠或融合均可在镜下区分:13h的培养物念珠菌与标本中的混杂菌都可形成微小菌落，经验丰富者可利用G-b比较透明等特点直接区分。金黄色葡萄球等G+C类与念珠菌均形成突起和混浊微小菌落，必须通过显微镜下区别。
       番茄琼脂玻片法培养念珠菌，未经治疗的患者可6h观察诊断，与常规培养法相比阳性符合率为72%;用药治疗的患者13h显微下观察结果，与常规培养法相比阳性符合率为100%。本法能将念珠菌初步诊断到属、结果准确、快捷、经济、方便、易推广，亦可用于全身性感染的其他标本，均可在6~13h及时发出报告，待获得纯菌后再做系统鉴定即可。
参考文献
1 冯贻泽、梁超.一种分离鉴别白色念珠茵的专一性培养基.微生物通报，1991:18(4):249.
2 崔福庆.番茄琼脂培养基快速分离酵母样真菌实验研究.齐鲁医学检验,1997:8(3):14.
3 刘恭植.微生物学与微生物检验.北京:人民卫生出版社，1987:261~410.
4 周文静.一种快速诊断酵母样真菌的方法及其评价.中华医学检验杂志，1989;12(6):355.
5 陈秀枢.酵母样真菌微量鉴定系统的研制及其临床方法评价.中华医学杂志.1992;15(3):160.
6 张军民.酵母样真菌酶反映模式的初步建立.中华医学检验杂志.1995; 18 (2):83.
7 高屹.TTC沙氏培养基分离鉴定念珠菌.中华医学检验杂志，1984; 7( 2):111.
8 TTC-WCG弯曲菌选择培养基分离念珠菌.中华医学杂志.1995;18(1) :52.
                                                                                                       编辑：范伟伟