 |  |  |  |
| 作者：沈立松 王维维 袁向亮 单位：上海交通大学医学院附属新华医院检验科 流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种能够对单个细胞或生物微颗粒的生物学性质进行定量分析和分选的检测手段，具有快速、高精度、高准确性、多参数和高通量等优点，是目前先进的细胞定量分析技术之一[1,2,3]。近年来，FCM的发展日新月异，技术不断有新的突破，新型仪器不断涌现，同时，FCM在医学及其他科学的应用更加广泛和深入，涵盖了从基础研究到临床诊断的多个方面，涉及免疫学、血液学、肿瘤学等[3,4,5]。 一、我国流式细胞术的应用现状 我国流式细胞仪的研制和流式细胞技术的应用历经30多年的发展，在临床和科研领域的应用都发挥了非常重要的作用。 1.流式细胞仪的使用现状： 流式细胞仪首先是由科学研究单位引进我国，逐渐进入到医疗系统，应用于临床。2011年有学者就我国流式细胞仪的应用情况做过调查和统计，单色、双色、三色及四色荧光标记分别占15.4% (53/344)、13.7% (47/344)、54.1%(186/344)及16.3%(56/344)[6]，仍以单激光较少荧光通道的仪器为主。 2.流式细胞术应用领域的现状： 目前我国FCM应用领域主要集中在下列方面(在此仅列出部分代表项目)：(1)免疫学领域：淋巴细胞亚群检测，用以评估机体的免疫状态、辅助疾病如AIDS/HIV的诊断等，是目前各医疗单位开展和应用最广泛的项目。(2)血液学领域：主要是血液系统疾病的免疫分型及白血病微小残留病变(minimal residual disease，MRD)监测，用于血液系统疾病的诊断、治疗评估和复发监测。FCM的细胞免疫分型是国际公认的诊断造血细胞疾病必不可少的重要标准之一，是目前被广泛接受和认可的免疫分型方法[7,8]。(3)临床肿瘤学：主要是DNA倍体和细胞周期分析，了解细胞DNA倍体和增殖能力，异常倍体的出现意味着DNA合成的异常，可能是肿瘤或是癌前病变发生的重要标志。(4)造血干细胞移植的应用：足够数量的造血干细胞是造血干细胞移植成功的关键因素之一，通过CD34标记和细胞计数微球同时使用，或者具有计数功能的流式细胞仪是鉴定和计数造血干细胞的快速、准确、定量的方法。 二、流式细胞术的近期进展 1．流式细胞仪的进展： 近年来，流式细胞仪性能不断提升，体现在分析速度的提高、灵敏度和精密度的提升，以及激光通道和参数的增多。此外，流式细胞仪不断打破传统的界限，实现了多学科的交叉发展，诞生了一些新理念、新技术融合的仪器。例如，微流控芯片流式细胞仪，是基于微机电技术的一种小型流式细胞仪，具有结构简单、操作方便、体积小、价格低廉等特点[9,10]；声波聚焦流式细胞仪是采用超声波原理将细胞聚焦于流动室的中轴上，代替传统的流体动力，实现高通量、高精确度分析；质谱流式细胞仪将传统流式细胞仪与质谱分析技术相结合，采用同位素标记特异性抗体，利用质谱原理对单细胞进行多参数检测的流式技术，可以克服荧光素发光光谱相互干扰导致的波谱重叠、影响分辨的问题；将传统的流式细胞仪的荧光信号与荧光显微镜的形态学结合，形成了成像流式细胞仪，检测者可以目睹到每个细胞或颗粒的形态。质谱流式细胞仪和成像流式细胞仪可以被称为二代流式细胞仪[11]。 2．流式细胞新技术的进展： FCM主要分析荧光标记的细胞和颗粒，也是目前广泛的应用领域。但是，新近研究打破了这一界限，实现了流式细胞仪由检测荧光标记的细胞，到可以检测无需荧光标记细胞的飞跃，这种技术对细胞无损坏、避免了荧光染料的干扰[12]，将进一步提升流式细胞术的应用范围和价值。有学者研究出一种新的流式细胞技术[13,14]，称为实时变形性流式细胞术(real-time deformability cytometry，RT-DC)，利用肿瘤细胞等细胞的内在特性——变形能力，对无标记的目标细胞分析，这种无标记的分析方法为流式细胞分析增加了新的可能。 3．流式细胞术的应用进展： 随着时间的推移，FCM应用范围也在不断扩大，新的一些临床检测和科研项目也在不断开发。 流式细胞术应用范围的扩展：FCM的检测生物物种不限于人类，也包括其他的物种，如动物[15]、植物[16,17]等。FCM所能检测的标本也不仅限于外周血和骨髓、淋巴结、淋巴瘤和实体组织，还可以检测灌洗液[18]、胸腹水[19,20]等；关于FCM的应用领域，笔者[4,5]曾介绍扩展到了生殖领域，如精子[21,22,23]和胚胎[15]的检测等并日臻成熟。 流式细胞术新项目的研发：(1)实体瘤的鉴定与监测：实体瘤(如神经母细胞瘤、肾母细胞瘤等)是非血液来源的一类异质性肿瘤，是婴幼儿常见的恶性肿瘤，其预后很大程度上依赖于肿瘤的早期诊断和治疗。以往，此类疾病的诊断主要依赖于病理，但病理检查耗时较长，不利于疾病的快速诊治。流式细胞术对不同类型的实体瘤免疫分型检测，有助于实体瘤的快速分类鉴定和早期治疗[24]。(2)细胞新亚群的鉴定：①Th1、Th2、Th17细胞的检测：Th亚群细胞的平衡对于人体正常免疫应答的发挥起着至关重要的作用，各细胞亚群的失衡会导致多种疾病的发生，如自身免疫性疾病、过敏性疾病、肿瘤等。②调节性T细胞(Treg)的检测：Treg细胞是一群具有免疫抑制性的T细胞亚群，在机体的免疫应答中发挥免疫抑制效应，与Th细胞之间的平衡参与多种疾病的发生发展，流式细胞术检测其标记主要为CD4＋CD25＋FoxP3＋或者CD4＋CD25＋CD127low/-，有研究发现CD6low可以作为Treg细胞的一个新的表面标记，此类细胞具有传统Treg相似的抑制效应[25]。③调节性B细胞(Breg)的检测：Breg是近年来发现和鉴定的一群具有调节功能的B淋巴细胞亚群，在自身免疫性疾病及肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用[26]，流式细胞术检测其标记主要为CD19＋CD5＋CD1dhi或者CD19＋CD24hiCD38hi。随着流式细胞术应用的不断进展，新的细胞亚群和新的指标也将不断的被发现。 三、我国流式细胞术应用面临的问题 我国FCM的应用迟于国外近10年，发展时日尚短，还面临着许多不足。 1. FCM设备和试剂的问题： 流式细胞仪是高端精密仪器，要求使用者掌握和具备免疫学、血液学、分子生物学等多学科的知识和技术，且仪器价格昂贵，这些因素阻碍了FCM在国内的应用和普及。FCM使用的试剂价格昂贵，也阻碍了项目的开展和应用。而且，国内许多荧光抗体未获得临床使用许可证，仅可用于科研，因此，许多检测项目和指标无法开展，不利于患者疾病的诊治，阻碍了在相关临床专业的发展。 2．FCM质量管理的问题： FCM质量管理包括有效性控制、质量控制、能力验证、标准操作流程的文件管理、人员培训评估、质量提升等[27]。由于FCM具有多参数的特点，从标本采集、处理到上机、分析是一个连续的过程，检测标本的采集运输与保存、流式细胞仪的校准与性能、所选择试剂的质量和搭配、人员的素质等都直接影响着检测结果的质量[28,29]。 目前，我国关于FCM的一些建议和标准在不断的涌现，如《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》(WS/T-360-2011)[30]，《流式细胞术临床应用的建议》[31]，《CD34阳性细胞绝对计数的流式细胞术测定指南》[32]。但是，我国FCM的质量管理还处在起步阶段，卫生部临检中心和上海市临检中心的室间质评仅包含部分检测项目[28]；尚无专门的机构对人员进行培训和认证；未形成全国统一的标准化检测流程和参考范围，缺乏可比性等。这些都是FCM质量管理应用发展中面临的问题。 四、展望 综上所述，我国FCM在临床和科研中广泛应用，且在仪器和技术方面取得了一定的进展，但是也应清楚的认识到FCM的技术发展和临床使用仍然有待日臻完善。 参考文献 [1]FulwylerMJ. Flow cytometry and cell sorting[J]. Blood Cells, 1980, 6(2):173-184. [2]VillasBH. Flow cytometry: an overview[J]. Cell Vis, 1998，5(1):56-61. [3]AdanA, AlizadaG, KirazY, et al. Flow cytometry: basic principles and applications[J]. Crit Rev Biotechnol, 2016，14(1):1-14. DOI: 10.3109/07388551.2015.1128876. [4]沈立松．流式细胞术的研究进展及临床应用前景[J]. 中华检验医学杂志，2009，32(3):260-262. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2009.03.005. [5]沈立松. 扩展流式细胞术的临床应用范围提高应用水平[J]. 中华检验医学杂志，2011，34(5):385-388. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2011.05.001. [6]万岁桂，林阳，徐娟．中国流式细胞术急性白血病免疫表型分析应用现状的调查[J]．白血病淋巴瘤杂志，2011，20(9):525-528. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9921.2011.09.005. [7]SwerdlowSH, CampoE, HarrisNL, et al. WHO classification of haematopoiefic and lymphoid tissues[M]. 4th edn. Lyon: International Agency for Research on Ccancer, 2008. [8]SabattiniE, BacciF, SagramosoC, et al. WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues in 2008: an overview[J]. Pathologica, 2010, 102(3):83-87. [9]叶晓兰，杜文斌，古淑青，等．小型微流控芯片流式细胞仪的研制[J]．分析化学，2008, 36(10):1443-1446. DOI: 10.3321/j.issn：0253-3820.2008.10.029. [10]ChenJ, XueC, ZhaoY, et al. Microfluidic impedance flow cytometry enabling high-throughput single-cell electrical property characterization[J]. Int J Mol Sci, 2015, 16(5):9804-9830. DOI: 10.3390/ijms16059804. [11]DoanH, ChinnGM, Jahan-TighRR. Flow Cytometry II: Mass and Imaging Cytometry[J]. J Invest Dermatol, 2015, 135(9):e36. DOI: 10.1038/jid.2015.263. [12]BlasiT, HennigH, SummersHD, et al. Label-free cell cycle analysis for high-Throughput imaging flow cytometry[J]. Nat Commun, 2016, 7:10256. DOI: 10.1038/ncomms10256. [13]OttoO, RosendahlP, MietkeA，et al. Real-time deformability cytometry: on-the-fly cell mechanical phenotyping[J]. Nat Methods, 2015，12(3):199-202.DOI: 10.1038/nmeth.3281. [14]OttoO, RosendahlP, GolfierS, et al.Real-time deformability cytometry as a label-free indicator of cell function[J]. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc, 2015, 15:1861-1864. DOI: 10.1109/EMBC.2015.7318744. [15]郑春静，吴雄飞，刘东海，等. 用流式细胞仪检测大黄鱼三倍体[J]．细胞生物学杂志，2006，28(2):253-256. DOI: 10.3969/j.issn.1674-7666.2006.02.027. [16]魏高明，方炎明. 栎属植物流式细胞术实验体系的建立与优化[J]. 南京林业大学学报(自然科学版), 2015，39(1):168-172. DOI: 10.3969/j.issn.1000-2006.2015.01.001. [17]倪金菁，贺彬，汪文杰，等．流式细胞法测定茅苍术基因组大小[J]．中药材，2015, 38(6):1153-1156. DOI: 10.13863/j.issn1001-4454.2015.06.010. [18]杨红，鹿英英，张中. 流式细胞术检测肺泡灌洗液淋巴细胞免疫表型的临床意义探讨[J]．中国实用医药，2015，10(17):14-16. DOI: 10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.17.006. [19]李乐，伍严安，黄源茂. 胸腹水脱落细胞流式细胞法DNA倍体分析的临床诊断价值[J]．福建医科大学学报，2007，41(2):159-161. DOI: 10.3969/j.issn.1672-4194.2007.02.018. [20]KrishanA, Ganjei-AzarP, HamelikR，et al. Flow immunocytochemistry of marker expression in cells from body cavity fluids[J]. Cytometry A, 2010, 77(2):132-143. DOI: 10.1002/cyto.a.20824. [21]陈军，邓强，韩东，等. 流式细胞仪分离精子的应用现状[J]. 新疆畜牧业，2013，6(1):7-9. DOI: 10.3969/j.issn.1003-4889.2013.06.003. [22]SharmaR, AhmadG, EstevesSC，et al. Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) assay using bench top flow cytometer for evaluation of sperm DNA fragmentation in fertility laboratories: protocol, reference values, and quality control[J]. J Assist Reprod Genet, 2016, 33(2):291-300. DOI: 10.1007/s10815-015-0635-7. [23]ShiX, WangT, QiuZL, et al.Effects of mechanical stresses on sperm function and fertilization rate in mice[J]. Syst Biol Reprod Med, 2016, 62(2)，152-159. DOI: 10.3109/19396368.2015.1115915. [24]Ferreira-FacioCS, MilitoC, BotafogoV, et al. Contribution of multiparameter flow cytometry immunophenotyping to the diagnostic screening and classification of pediatric cancer[J]. PloS One, 2013, 8(3):e55534. DOI: 10.1371/journal.pone.0055534. [25]Garcia SantanaCA, TungJW, GulnikS. Human treg cells are characterized by low/negative CD6 expression[J]. Cytometry A, 2014, 85(10):901-908. DOI: 10.1002/cyto.a.22513. [26]WangWW, YuanXL, ChenH, et al. Increased CD19＋ CD24hi CD38hi Breg involved in immunosuppression by downregulating helper T cells and upregulating regulatory T cells in gastric cancer[J]. Oncotarget，2015, 32 (6):33486-33499. DOI: 10.18632/oncotarget.5588. [27]OldakerTA. Quality control in clinical flow cytometry[J]. Clin Lab Med, 2007, 27(3):671-685. [28]吴丽娟，许东升，Betty Li. 流式细胞检验的质量控制与生物安全管理[J]. 临床检验杂志，2013，31(2):142-144. DOI: 10.13602/j.cnki.jcls.2013.02.015. [29]吴丽娟，许东升. 流式细胞术表型分析的质量控制[J]. 中华检验医学杂志，2011，34(5):389-394. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2011.05.002. [30]崔巍. 流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南. 2011, WS/T-360. [31]中华医学会检验医学分会，卫生部临床检验中心，中华检验医学杂志编辑委员会. 流式细胞术临床应用的建议[J]. 中华检验医学杂志，2013, 36(12):1064-1073. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2013.12.003. [32]刘艳荣. CD34阳性细胞绝对计数的流式细胞术测定指南. 中华血液学杂志，2015，36(7)：539-546. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2015.07.002. |
|关于我们|医维基|网站地图|Archiver|手机版|医疗之家
( 沪ICP备2023001278号-1 )
GMT+8, 2025-6-9 02:14 , Processed in 1.401049 second(s), 17 queries .
Powered by Discuz! X3.5 Licensed
© 2001-2025 Discuz! Team.
