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作者：权文强 李冬 单位：同济大学附属同济医院检验科 流式细胞术( flow cytometry，FCM)作为一项诞生超过半个世纪的多学科综合技术，经过多年的发展日臻成熟。尤其进入21世纪以后，FCM已经越来越完善，逐渐成为细胞学及医学检验领域中不可替代的一项重要工具[1]。FCM具有检测样品快速、准确以及敏感性高等特点，可从一个细胞中测得多个参数，为疾病诊断提供了一种强有力的手段和全新的医学视角。 当今社会，肿瘤疾病已经成为了威胁人类健康的头号杀手，即便在人类医学科技迅速发展的今天，对于肿瘤的治疗仍是一大难题，其根本原因是我们对肿瘤的发生、发展、转移和复发的机制仍不完全清楚。FCM基于其独特的细胞分选原理和强大荧光标记技术，在临床实验室的应用已经全面的覆盖了包括血液肿瘤、微小残留病(minimal residual disease，MRD)、各种实体瘤的诊断和预后监测，包含的技术原理相信也已经受到了大众的熟知及认可。笔者对FCM在肿瘤疾病诊断方面的应用，尤其在肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)、循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)检测方面的新进展进行阐述。 一、FCM在白血病诊断方面的应用 流式细胞免疫分型已成为血液系统肿瘤的诊断、分类、分期及监测的必需工具[2]。在各种急性白血病的诊断和鉴别中，一般形态学检查很难区分，而FCM起到了举足轻重的作用。在白血病免疫分型方面，目前国内外均主张采用FCM CD45/SSC(侧向角散射，side scatter)双参数散点网设计方法进行分型[3]，该法可以将骨髓细胞清晰地分成淋巴细胞、成熟粒细胞、单核细胞、幼稚细胞和有核红细胞群，排除了正常细胞对免疫分型的干扰，使细胞免疫分型的准确性显著提高。2013年中华医学会检验医学分会等[1]发布的有关流式细胞术临床应用的专家指南与共识中指出了常用的FCM检测和鉴别急性白血病各系列的特异性标志抗体组合推荐方案。当然，急性白血病的FCM免疫分型不仅依据谱系特异性抗体和相关抗体，还要进一步结合形态学、化学染色以及遗传学检测等综合判断。 另外，FCM在监测微小残留病(minimal residual disease，MRD)具有独到优势：虽然实时荧光定量PCR技术(real-time quantitative PCR，QPCR)技术是目前灵敏度最高的MRD检测方法，但对于多数无分子生物学异常的白血病患者来说，由于PCR产物与白血病细胞数目间没有确定的比例，很难对残存的白血病细胞做出精确评估。况且，白血病细胞的异常分子标记也具有一定的不稳定性，这也为PCR监测MRD带来了困难。因此，FCM通过对MRD的白血病相关免疫表型(leukemia-associated immunophenotype，LAIP)检测，比RT-PCR技术更直观的对残留白血病细胞进行准确定量[4]，且敏感度也可达到10-4甚至10-5 ，成为了检测MRD最有前景的一种方法。 二、FCM在肿瘤标志学检测方面的应用 通过FCM来检测细胞DNA含量，分析癌细胞DNA倍体，是FCM对肿瘤标志物研究中提出最早、结论最明确、应用价值最大的研究成果之一[5]。FCM通过检测细胞中DNA的含量变化从而运用于实体肿瘤的检测，所以在病理形态学诊断上一直把FCM技术视为肿瘤诊断的一个重要方面。 流式细胞术作为一门生物检测技术日臻完善，结合后期发展的CBA(cytometric bead array)技术，不仅可以检测肿瘤细胞表面、细胞浆和细胞核中的各种成分标志和功能标志，而且还可以检测肿瘤患者各种体液中的大分子物质所携带的各种肿瘤标志物。这样，FCM把分析细胞学和肿瘤学研究巧妙地结合并互补，使它们很好地融合在一起[6]：(1)FCM可以通过对肿瘤细胞DNA倍体分类，来探讨肿瘤细胞生物学特性；(2)对肿瘤细胞的细胞周期、增殖活性、细胞凋亡水平和细胞分化情况分析，可以探讨肿瘤细胞动力学标志的特征；(3)对肿瘤细胞各种基因如癌基因中的ras基因族、myc基因族、p21、bcl-2、cerbB-2等，抑癌基因p53、RB、p16等，与肿瘤转移相关的基因CD44S、CD44V5、CD44V6、Nm23等，细胞凋亡相关基因caspases-3、Annexin V、Survivin、CD95等的表达水平，以及肿瘤相关抗原细胞角蛋白(cyto-keratin，CK)、癌胚抗原(carcinoenbryonic antigen，CEA)、上皮膜抗原(epithelial membrane antigen，EMA)等的检测和分析，可以探讨肿瘤细胞基因表达特征；(4)对肿瘤患者淋巴细胞及其亚群、巨噬细胞、树突状细胞、细胞因子等的检测分析，可以探讨肿瘤患者的免疫学标志特征。总而言之，采用流式细胞术对肿瘤及相关细胞各种参数的检测和分析，可以使肿瘤诊断学研究水平得到进一步提升。 三、FCM在CSCs检测中的应用 "肿瘤干细胞假说"认为在肿瘤组织中只存在少部分具有无限自我更新能力并能产生出异质性肿瘤细胞的细胞，而大部分肿瘤细胞处于不增殖或有限增殖的状态。研究发现，这类细胞与肿瘤的发生、生长、转移和复发有密切关系，已被证实在急性粒细胞白血病、肺癌、乳腺癌、胃肠道肿瘤、神经胶质瘤等均存在[7,8,9,10,11]。由于其具有自我更新和无限增殖能力以及多向分化潜能，故称之为CSCs。 目前研究认为[12]，CSCs对常规治疗有抵抗性，具有再次形成肿瘤的能力，其可能是肿瘤复发转移的根源。因此，可以预见CSCs将会在根治肿瘤和解决肿瘤复发转移等问题上发挥重要作用。为了研究CSCs的生物学特性，如何分离出CSCs是关键的一步，然而肿瘤组织中的CSCs所占比例非常小，仅0.01%～2.00%，分离较为困难。 1．利用FCM对CSCs分离纯化： 流式细胞术分选(fluorescence activated cell sorting，FACS)也称荧光活化细胞分选法，主要是通过将待分选的肿瘤干细胞和肿瘤细胞利用一种或两种以上可以激发不同波长荧光素如FITC、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)等标记的单克隆抗体标记为单细胞悬液后，通过FACS分选，可以区别出细胞表面表达有差异的特异蛋白(如某些CD分子等),或在肿瘤干细胞上表达上调或下调的蛋白，以此分离出CSCs[13]。FACS技术是目前应用最广泛的CSCs的分离方法，特异性与敏感性均较强，但设备成本、技术要求也较高，国内应用还有进一步推广的空间。故实际研究中，一般会采用两种或两种以上的方法来分离CSCs，以获得更多、纯度更高的的CSCs，如利用无血清培养基(serum-free medium，SFM)分选法培养后，再经过免疫磁珠分选法(magnetic activated cell sorting，MACS)或FACS来分选出数量上和纯度上均满足实验要求的CSCs。 对于目前仍未有表面标志物的肿瘤干细胞的分离，可以利用侧群细胞(side population，SP)分选法，Kondo等[14]证明大多数肿瘤细胞系中存在侧群细胞，且这些侧群细胞具有与CSCs相同的表面标志物，多向分化和少量成瘤的特性。ATP结合盒式蛋白(ATP-bindingcassette transporter，ABC)转运蛋白家族中ABCG2(ATP-bindingcassette superfamily G member 2)被认为是一种筛选CSCs的表面标志物分子[15,16]，其与CSCs对核酸染料Hoechst 33342拒染的特性有关，Hoechst 33342在紫外光激发下可发出蓝色荧光(波长450 nm左右)和红色荧光(波长650 nm左右) ，而CSCs可将染料外排，不发出荧光，从而运用FCM可以将这类侧群细胞分离出来。分离得到的SP细胞经鉴定就可确认为CSCs。 2．利用FCM对肿瘤干细胞(CSCs)鉴定： 分离出的肿瘤干细胞与肿瘤细胞仍有很大的相似性，必须通过FCM等方法对细胞表面标志物表达情况测定后予以确认。表1为目前已经得到确认的适合FCM分析检测的肿瘤干细胞表面特异性标志物[17]。  四、FCM与CTCs 肿瘤的个体化治疗已成为现代医学发展的方向。一般肿瘤的治疗方法包括肿瘤切除、放疗、化疗和靶向治疗，而个体化治疗的要求医生在治疗过程中针对病情实现对肿瘤的发生、发展情况进行长期监测，以便及时调整治疗方案。CTCs指从肿瘤原发灶或转移灶脱落并进入外周血循环的肿瘤细胞。CTCs作为一种非侵入性的诊断工具，在肿瘤的发生、发展、早期转移、疗效监测、预后评估及个体化治疗方面都有重要的临床意义[18]。 CTCs在外周血中数量相对较少，每106～107个白细胞中才有1个CTC，精确分离很困难。为了达到目前检测技术灵敏度的下限，需要对样本中的肿瘤细胞进行富集，但是富集技术本身易造成CTCs的丢失，因此降低检测的敏感性。 流式细胞术检测CTCs的基本原理是将CTCs微调富集过程和流式细胞仪多色分析相结合，当输出和输入的细胞数在0到几百时，可以呈现线性关系[19]。Takao和Takeda[20]在肺癌PC-9系和乳腺癌MCF-7系上进行检测并取得了很好的效果。通过此法检测CTCs，可以保留细胞的形态学特征和抗原性，并进行理化特性的参数分析，但对设备要求较高。FAST流式细胞仪可以收集Alexa555和Alexa488两种结合了4'，6-联脒-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)的CK＋抗体荧光标记模式的稀有细胞在玻璃基板上，并通过收集使用大通量纤维束的荧光发射来实现比传统数字化显微镜快500倍的速度扫描这些细胞[21]。此法灵敏度高，不必富集细胞就可以检测到稀少的CTCs，但主观性强，价格昂贵，限制了其应用。 对于特异性循环肿瘤细胞的检测技术研究还处于刚刚开始的阶段。特异性CTC的检测需要两个特定的前提：一是某一肿瘤特异性的标志物，并且这一标志物在细胞膜上有高表达；其次就是需要拥有针对这一标志物的特异性抗体，且和标志物抗原具有高度的亲和力。凌芸等[22]采用特异性识别人肺腺癌细胞株SPC-A1的单克隆抗体NJ001进行荧光标记，建立流式细胞术检测小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLCC)的方法。该技术只需要100 μl外周血，检测20万个外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，就可对大多数的早期手术病例前后的SCLCC进行监测，且该检测技术具有较好的灵敏性、很高的准确性和特异性。Watanabe等[23]基于FCM开发出来一种多色CTCs检测系统，利用对上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)、CK、CD45分子的不同荧光标记对乳腺癌、前列腺癌、结肠癌中的CTCs阳性细胞进行分离检测，结果具有良好的相关性和线性。刘志勇和李宝江[24]选择乳腺癌上皮细胞或上皮细胞来源的乳腺癌细胞胞浆内的细胞骨架组成成分CK8/18为标记物，采用FCM检测乳腺癌患者外周循环血中CTCs的阳性值，也取得了非常好的效果。Lu等[25]通过收集10 ml结肠癌患者的外周血，利用流式细胞术结合肿瘤细胞表面分子标志物CD47＋、CD44＋的检测，对无富集的CTCs检测分析，发现CTCs数量与结肠癌TNM分期明显相关，且细胞可继续培养，为FCM检测CTCs提供了新的思路。 五、展望 精准医疗时代已经到来，恶性肿瘤的治疗同样要遵循精准医疗的原则。而在精准肿瘤医学模式中，肿瘤疾病的精确诊断是精准治疗的关键。新的时代背景下，分子诊断新技术正如雨后春笋般涌现，利用各种基因检测技术如荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)、RT-PCR、sanger基因测序及一些高通量分子测序技术对肿瘤进行分子分型诊断或治疗逐渐成为趋势。但流式细胞术凭借其独特检测原理及强大荧光标记技术仍将在肿瘤的早期诊断中发挥不可替代的作用，在未来，FCM将与组织学诊断，分子诊断等完整的结合在一起，给临床提供一个更准确，更完整的疾病诊断报告。 参考文献 [1]中华医学会检验医学分会，卫生部临床检验中心，中华检验医学杂志编辑委员会. 流式细胞术临床应用的建议[J]．中华检验医学杂志，2013，36(12):1064-1073. 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