 |  |  |  |
| 作者：上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心检验科 傅启华、王剑 "罕见病"又称为"孤儿病"，是指患病率极低的一大类疾病。WHO将罕见病定义为患病人数占总人口的0.65‰～1.00‰之间的疾病或表型[1]。我国于2010年5月在上海达成了专家共识，将中国罕见病定义为"患病率<1/50万，或新生儿发病率< 1 /1万"[2]。根据对已有文献报道及相关数据库的统计，按照各国对罕见病的定义，目前约有7 000种疾病被确定为罕见病，约占人类疾病的10%[3,4]。罕见病除了种类繁多外，还具有误诊率高、诊断困难和可治性低等特点，给家庭和社会带来沉重的负担[1]。由于大多数的罕见病属于遗传性疾病，是由于人类基因组上某个基因或区域发生变异所引起的[3]，因此，开展针对此类疾病的遗传学研究和基因诊断显得尤为重要。 一、经典的基因诊断技术与下一代测序技术 人类基因组变异的范围大小可以从单个碱基到整条染色体不等，主要可分为染色体异常、拷贝数变异(copy number variants，CNVs)、以及单个或多个碱基的变异(single/multiple nucleotide variations，SNVs)[5]。根据变异大小的不同，经典的基因检测方法有染色体核型分析、基因芯片、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)、多重连接依赖的探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)和Sanger测序等[6,7]。 下一代测序(next generation sequencing，NGS)是最近几年诞生的全新的DNA测序技术，它能同时对几十万至几亿的DNA分子进行平行测定，与传统的一代测序技术(Sanger测序)相比，具有高通量、高敏感性等优势，因此也称为"高通量测序技术"[8,9]。NGS主要流程可分为文库建立、上机测序和数据分析解释等步骤[9]，按测序目标序列的大小可分为全基因组测序(whole genome sequencing，WGS)和靶向重测序(targeted resequencing)。靶向重测序又可分为全外显子组测序(whole exome sequencing，WES)和靶向目标基因测序(targeted panel sequencing，TPS)。随着NGS技术的逐步成熟、费用的降低和实验周期的缩短，使得其在大规模人群中的运用成为现实。目前NGS正越来越多被应用于科学研究和临床诊断中[8,9,10]。 二、NGS技术发现罕见病新致病基因 根据在线人类孟德尔遗传(online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)数据库和Orphanet等网站的统计，目前已报道的7 000多种疾病或表型中，约有4 000多种已明确致病基因，但还有3 000多种致病机制不清[11]。以往对于发现罕见遗传性疾病的新致病基因主要通过家系遗传连锁分析方法，但整个实验过程需要花费大量时间和精力，而且这个方法受到诸多因素的限制(如患者人数少、家系小等)，而NGS则可以有效克服这些限制[12]。2009年9月Sarah等[13]在Nature杂志上发表了第一篇利用全外显子组测序研究遗传性疾病的方法学文章，通过对Freeman-Sheldon综合征患者的高通量测序，证实了NGS方法的准确性和可行性。他们将此项技术进一步应用于未知病因遗传性疾病的研究，成功揭示了Miller综合征的致病基因[14]，证实NGS技术可用于发现罕见遗传性疾病的新致病基因。随后通过外显子组测序又发现了Schinzel-Giedion综合征、Kabuki综合征和家族性β-脂蛋白过少血症等多种罕见遗传性疾病的新致病基因[9]。截至2013年1月，至少有150多个新的致病基因在罕见单基因遗传病中被发现[15]。因此，NGS已成为目前鉴定罕见病新致病基因最重要的研究工具。 三、下一代测序在罕见病诊断中的临床应用 随着NGS技术的不断完善和生物信息学技术的高速发展，近几年来WES和TPS方法正逐步被越来越多地用于临床诊断的实践领域，利用测序信息结合临床表型可对遗传性疾病做出正确的分子诊断[10]，特别是对于那些临床诊断困难的罕见疾病具有重要的意义，可以利用NGS技术进行临床分子诊断从而直接影响临床治疗的决策。 2009年Choi等[16]报道通过WES技术对1例临床疑似为Batter综合征的罕见病患儿作出"先天性氯化物丢失性腹泻"的正确诊断，提出了将WES应用于临床诊断领域的可行性和必要性。2011年9月美国Ambry Genetics公司宣布作为CAP认可和CLIA认证的实验室第一个正式向临床提供WES服务，用于罕见遗传性疾病的临床诊断[17]。Dixon-Salazar等[18]检测了118个临床诊断为隐性神经发育性疾病患者的全外显子组，结果19%的病例找到了致病基因突变，其中有10个病例依据基因检测结果而改变了最初的临床诊断和治疗方式。2013年10月，国际顶级医学期刊《新英格兰医学杂志》发表了来自美国贝勒医学院的临床诊断总结报告，该研究应用WES对250个不同表型的遗传性疾病患者进行了检测，结果至少有25%的患者得到了明确的基因诊断[19]。相信随着对医学基因组学知识的不断更新和各种数据库资源的积累，未来将有更多的病例可以被明确诊断。 TPS可以对某一类疾病(或表型)已知致病基因及相关通路上的基因进行高通量平行测序，在最大限度发挥高通量优势的同时，相对有利于下游生物信息学分析，并可有效节约实验成本，因此非常适合临床实验室对罕见遗传性疾病进行基因诊断。方法学研究也显示，TPS技术敏感度达到100%，特异度也接近100%。当每个碱基的测序深度达到30×以上时，99%以上的变异都能被检出，因此TPS可以替代传统的Sanger测序用于临床分子诊断[20]。近年来有研究陆续报道利用NGS技术建立了针对线粒体疾病[21]、神经肌肉疾病[22]、心肌病[23]、视网膜病[24]等疾病的分子诊断方法，应用于疾病的诊断、风险分层及预后判断等，取得了良好的效果。 四、面临的主要问题与挑战 目前NGS正被越来越广泛应用于罕见病的临床分子诊断中，但也存在许多诸如法律法规、伦理、质量控制等方面的问题，特别是面临着"如何解释海量变异"这一艰巨的挑战[25]。 1．变异解释问题： NGS会产生海量的数据，如何在庞大的数据中分析出可靠、有意义的结果，如何正确、合理解释基因组变异，使之在临床诊疗能够有效应用已成为目前最为棘手的问题。以下任一情况的发生，都将可能导致临床误诊或延误治疗[26]。(1)错误地将部分"良性"基因或变异归类为"致病性"基因或变异，例如Piton等[27]通过统计健康人群的WES变异数据库，发现以往报道的106个与X连锁智力落后相关的致病基因中至少有25个是有疑问的，需要重新评估其病理意义；(2)夸大或过度解释部分变异在临床诊疗中的作用，特别是对于疾病"易感基因(或倾向性基因)"的检测等；(3)由于目前的医学知识对于人类基因组变异导致疾病的病理意义还有一定的局限性(特别是在罕见病中)，且从业人员所掌握的专业知识及经验"良莠不齐"，因此往往会遗漏真正的"致病性"变异。 2．标准化问题： 目前由于各个实验室所采取的建库、富集、测序等实验方法的不同，特别是需要考虑经济成本方面的因素，致使数据质量方面差异较大[28]。另外由于各个临床实验室所涉及的疾病谱差异，对于测序质量的要求也不一致，如检测体细胞突变性疾病需要更高的测序深度[29]。这些因素使各实验室所制定的参数标准不统一，如测序深度、均一性、覆盖度及准确性等。 3．法律法规及伦理问题： 基因组测序属于当代前沿技术研究范畴，涉及伦理、隐私和人类遗传资源保护、生物安全等敏感问题。 五、展望 尽管NGS在罕见病的临床诊断应用中存在诸多问题，许多国家的行业机构及政府部门对此已经进行了有益的探索。美国医学遗传学和基因组学学会、美国病理学家协会相继出台了临床实验室NGS标准指南，从文件体系、实验过程、变异解释、报告出具、质量控制、伦理等多个角度对NGS的临床应用进行了系统阐述。荷兰临床遗传实验诊断协会也发表了NGS的临床实践指南，提出了"诊断效能"、"诊断路径"及"核心疾病基因"等概念。这些都为制定具有我国特色的NGS技术临床分子诊断应用指南和标准化建设，提供了积极的借鉴意义。 相信随着对罕见病研究的不断深入、NGS技术的不断发展、变异数据库的建立，以及相关法律法规的完善，NGS在罕见病临床分子诊断领域的应用将逐步普及。 参考文献 [1]李定国. 罕见病防治：不仅仅是知识和技术[J]. 诊断学理论与实践, 2014 (1):1–3. [2]马端, 李定国, 张学, 等. 中国罕见病防治的机遇与挑战[J]. 中国循证儿科杂志, 2011 (2):81–82. [3]AbbottA. Rare-disease project has global ambitions[J]. Nature, 2011, 472(7341):17. [4]DodgeJA, ChigladzeT, DonadieuJ, et al. The importance of rare diseases：from the gene to society[J]. Arch Dis Child, 2011, 96(9):791–792. [5]TomStrachan and AndrewRead. Human molecular genetics[M]. 4th ed. Publisher:Garland Science, 2010. [6]傅启华, 郑昭璟. 基于染色体芯片分析的产前诊断[J]. 中华检验医学杂志, 2013, 36(1):6–10. [7]姚如恩, 余永国, 耿娟, 等. MLPA技术在三种遗传性疾病基因诊断中的应用[J]. 中华检验医学杂志, 2013, 36(2):136–140. [8]DaveyJW, HohenlohePA, EtterPD, et al. Genome-wide genetic marker discovery and genotyping using next-generation sequencing[J]. Nat Rev Genet, 2011, 12(7):499–510. [9]BamshadMJ, NgSB, BighamAW, et al. Exome sequencing as a tool for Mendelian disease gene discovery[J]. Nat Rev Genet, 2011, 12(11):745–755. [10]YuY, WuBL, WuJ, et al. Exome and whole-genome sequencing as clinical tests：a transformative practice in molecular diagnostics[J]. Clin Chem, 2012, 58(11):1507–1509. [11]McKusickVA. Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM[J]. Am J Hum Genet, 2007, 80(4):588–604. [12]BoycottKM, VanstoneMR, BulmanDE, et al. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing：discovery to translation[J]. Nat Rev Genet, 2013, 14(10):681–691. [13]NgSB, TurnerEH, RobertsonPD, et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes[J]. Nature, 2009, 461(7261):272–276. [14]NgSB, BuckinghamKJ, LeeC, et al. Exome sequencing identifies the cause of a mendelian disorder[J]. Nat Genet, 2010, 42(1):30–35. [15]ZhangX. Exome sequencing greatly expedites the progressive research of Mendelian diseases[J]. Front Med, 2014, 8(1):42–57. [16]ChoiM, SchollUI, JiW, et al. Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(45):19096–19101. [17]PRNewswire. Ambry genetics first to offer exome sequencing service for clinical diagnostics[J/OL]. ALISO VIEJO, Calif., 2011. http://www.prnewswire.com/news-releases/. [18]Dixon-SalazarTJ, SilhavyJL, UdpaN, et al. Exome sequencing can improve diagnosis and alter patient management[J]. Sci Transl Med, 2012, 4(138):138ra78. [19]YangY, MuznyDM, ReidJG, et al. Clinical whole-exome sequencing for the diagnosis of mendelian disorders[J]. N Engl J Med, 2013, 369(16):1502–1511. [20]Sikkema-RaddatzB, JohanssonLF, de BoerEN, et al. Targeted next-generation sequencing can replac Sanger sequencing in clinical diagnostics[J]. Hum Mutat, 2013, 34(7):1035–1042. [21]CalvoSE, ComptonAG, HershmanSG, et al. Molecular diagnosis of infantile mitochondrial disease with targeted next-generation sequencing[J]. Sci Transl Med, 2012, 4(118):118ra10. [22]VasliN, BöhmJ, Le GrasS, et al. Next generation sequencing for molecular diagnosis of neuromuscular diseases[J]. Acta Neuropathol, 2012, 124(2):273–283. [23]MederB, HaasJ, KellerA, et al. Targeted next-generation sequencing for the molecular genetic diagnostics of cardiomyopathies[J]. Circ Cardiovasc Genet, 2011, 4(2):110–122. [24]AudoI, BujakowskaKM, LéveillardT, et al. Development and application of a next-generation-sequencing (NGS) approach to detect known and novel gene defects underlying retinal diseases[J]. Orphanet J Rare Dis, 2012(7):8. [25]LohmannK, KleinC. Next generation sequencing and the future of genetic diagnosis[J]. Neurotherapeutics, 2014, 11(4):699–707. [26]WangJ, ShenY. When a “disease-causing mutation” is not a pathogenic variant[J]. Clin Chem, 2014, 60(5):711–713. [27]PitonA, RedinC, MandelJL. XLID-causing mutations and associated genes challenged in light of data from large-scale human exome sequencing[J]. Am J Hum Genet, 2013, 93(2):368–383. [28]SimsD, SudberyI, IlottNE, et al. Sequencing depth and coverage：key considerations in genomic analyses[J]. Nat Rev Genet, 2014, 15(2):121–132. [29]JamuarSS, LamAT, KircherM, et al. Somatic mutations in cerebral cortical malformations[J]. N Engl J Med, 2014, 371(8):733–743. |
|关于我们|医维基|网站地图|Archiver|手机版|医疗之家
( 沪ICP备2023001278号-1 )
GMT+8, 2025-6-9 14:39 , Processed in 0.154240 second(s), 17 queries .
Powered by Discuz! X3.5 Licensed
© 2001-2025 Discuz! Team.
