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| 作者：常菁华1, 王剑飚2 单位：1.上海交通大学医学院附属瑞金医院药剂科, 2.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科, 乙二胺四乙酸(EDTA)依赖性假性血小板减少症(ethylenediaminetetraacetic acid dependent pseudothrombocytopenia,EDTA-PTCP)是由于抗凝剂EDTA诱导血小板中的特殊蛋白使血小板发生凝集,且在全自动血液分析仪上检测时,其血小板计数出现假性减少的现象[ 1]。血液分析仪测定血小板时常会出现假性减少,其原因包括:抽血不当、抗凝剂影响、巨大血小板、血小板卫星现象、药物影响等。其中抗凝剂的影响,尤其是作为血常规常用抗凝剂的乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)可导致假性血小板减少,引起国内外的高度关注。目前国内外有大量与其相关的文献报道和病例报道。由于这种假性血小板计数减低会导致临床增加不必要的辅助检查,甚至引起临床误诊、误治,带给患者心理上的压力及身体上的痛苦,导致医疗资源的浪费。因此,提高假性血小板减少症的检测水平,改进其检测的流程已受到广泛重视。 材料和方法 一、试剂和仪器 EDTA-K2真空采血管、枸橼酸钠抗凝真空采血管均由碧迪(BD)医疗器械(上海)有限公司提供;0.1 g/mL阿米卡星由上海信谊金朱药业有限公司提供;瑞氏-吉姆萨染色液由深圳贝索公司生产;SYSMEX XS-800i全自动血液分析仪(简称XS-800i)使用原厂配套试剂和质控品,质控在控。 二、对象 选择在瑞金医院就诊,并被确诊为EDTA-PTCP的患者5例。在患者签署知情同意书后进行相关检测。其中女性患者3例(包括1例孕妇),年龄从2557岁;男性患者2例,年龄3040岁。本次实验的5名患者从事职业广泛,无相关性。 三、方法 1.未加入阿米卡星的EDTA-K2抗凝血不同时间段血小板数检测 每位患者分别用 EDTA-K2抗凝管抽取静脉血2 mL,在不同时间段(即刻、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5 h)用XS-800i检测各管血小板数,同时进行各时间段样本血涂片检查,做好相应血涂片标记。 2.加入阿米卡星的EDTA-K2抗凝血不同时间段血小板数检测 EDTA-K2抗凝管分别在放置不同时间段后(即时、0.5、1、1.5、2、2.5 h)分别加入6.5 mg/mL阿米卡星(预实验效果最佳,故本研究均选取终浓度为6.5 mg/mL阿米卡星),每管加入阿米卡星后放置各解离时间(0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5 h)测定各管血小板数,同时进行各时间段样本的血涂片检查,做好相应血涂片标记。 3.枸橼酸盐抗凝血不同时间段血小板数检测 每位患者分别用枸橼酸盐抗凝管抽取静脉血3 mL,在不同时间段(即刻、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5 h)用XS-800i检测各管血小板数,同时进行各时间段样本血涂片检查,做好相应血涂片标记。 4.血涂片瑞氏-吉姆萨染色镜检 将上述已标记的血涂片进行瑞氏-吉姆萨染色,并在显微镜下进行观察。若见血小板成聚集状伴(或不伴)白细胞周围成卫星现象,则为镜下观察到血小板聚集。 结果 一、各抗凝血不同时间段血小板数检测 EDTA抗凝血立即检测患者2、患者3可得到理想结果(血片无聚集血小板),抽血即时加入阿米卡星的患者1、患者2及患者3可获得理想结果,患者4和患者5需室温放置4 h后检测才能获得理想结果。枸橼酸钠抗凝血立即检测患者2、患者3及患者5结果理想。见表1:    二、不同时间段加入阿米卡星的EDTA-K2抗凝血血小板数检测 患者1、患者2、患者3即刻至1.5 h内加入阿米卡星后,血小板能恢复至正常水平,之后每隔30 min加入阿米卡星,其作用效果明显降低,见表4。患者4及患者5加入阿米卡星后,其血小板水平逐渐升高至正常水平,在2.5 h内加入均能获得良好效果,见表5:   三、5例患者的检测直方图分析 分别观察5例患者XS-800i的检测直方图,发现有被系统误认为是白细胞的血小板凝集造成的波峰,同时血小板计数低下。在加入阿米卡星后,白细胞和血小板的直方图趋于正常,无异样波峰出现,见图1:  图1 患者1的检测直方图 四、5例患者的血涂片分析 患者13血涂片结果显示EDTA-K2抗凝血中未加入阿米卡星时,血涂片中发现大量血小板聚集。在不同时间加入阿米卡星,作用不同时间以后,患者抗凝血涂片观察到有不同程度的血小板解离,血小板散在分布。患者4及患者5 EDTA-K2抗凝血中加或不加阿米卡星,血涂片即刻检测发现大量血小板聚集;随着时间延长血小板聚集减少,呈散在分布。 讨论 1969年Gowland等[ 3]第1次报道了EDTA-PTCP,发生率一般为0.07%2.0%。40余年来,相关病例报告层出不穷,报告中有通过水浴、更换抗凝剂、使用氨基糖甙类药物等来解决。关于EDTA-PTCP发生机制的研究也持续了40余年,其包括EDTA导致患者抗凝血中针对血小板膜表面抗原的抗体增多,发生抗原抗体反应;血小板糖蛋白Ⅱb(GPⅡb)与血小板糖蛋白Ⅲa(GPⅢa)间存在一种单克隆抗体,当此抗体遇到EDTA抗凝剂时会引起血小板凝集[ 2];血小板表面带负电荷的磷脂抗体与由EDTA修饰的血小板膜表面抗原结合从而发生血小板凝集;温度依赖性等。 发生人群可见于健康体检、血小板供血者、门诊患者及住院患者中,分布相当广泛。 1997年,Sakurai等[ 4]报道氨基糖甙类的抗菌药物能作用于EDTA-PTCP阻止和解离患者聚集的血小板。2007年周小棉等[ 6, 7]报道能用其它抗凝剂,如枸橼酸盐、NaF代替EDTA能得到准确的血小板计数。2011年,Zhou等[ 5]报道了1例多抗凝剂依赖的假性血小板减少症患者,此患者在使用每一种抗凝剂后,都会出现假性血小板减少,并得出氨基糖甙类的抗菌药物阿米卡星不仅能作用于EDTA-PTCP,也能作用于多抗凝剂依赖的假性血小板减少,而且只有阿米卡星能在不影响其它血细胞形态特征的前提下抑制血小板的聚集,其它氨基糖苷类抗菌药物并不具有和阿米卡星一样的作用。结合本研究发现选择氨基糖甙类药物阿米卡星对假性血小板减少实验室检测提供了解决思路。 上述研究结果表明,对于患者1、2、3抽血时即刻在其EDTA-K2抗凝血管中加入阿米卡星能抑制血小板发生凝集,在抽血后加入阿米卡星能解离其凝集的血小板。在血涂片中除观测到极少数的血小板聚集外,血小板形态基本正常。此结果表明,阿米卡星能在不引起其他血细胞形态改变的前提下解离聚集的血小板。基于此发现,我们得出结论,阿米卡星能抑制和解离多抗凝剂依赖性假性血小板减少。所以,EDTA-PTCP患者在EDTA抗凝血中加入阿米卡星能纠正不正确的血小板计数。 对于患者4、患者5加或不加阿米卡星的抗凝血中,血小板数随时间延长而增加,与单纯EDTA抗凝相比,阿米卡星起到加速解聚的作用。在血涂片中发现血小板形态发生改变,形成丝状伪足相互缠绕,中间出现淡蓝色类冷球蛋白物质,血小板发生凝集,全血血小板检测时血小板数下降。随着放置时间的延长,EDTA使缠绕的血小板解散,血小板数增加。此结果提示患者4、患者5可能为放置时间或温度引起的假性血小板减少。 由于阿米卡星对5位患者表现不尽相同,可分为2组,即阿米卡星敏感型(患者13)和加速型(患者45)。更换枸橼酸钠抗凝剂只能在抽血即时检测解决阿米卡星敏感型患者,对加速性患者是无效的,且随着放置时间的推移,血小板会逐步降低,而此5例患者添加阿米卡星的血小板检测结果在4 h内保持稳定,结果可靠。 基于阿米卡星在EDTA依赖假性血小板减少中的作用,我们制定以下实验室解决思路:血常规检测血小板减低,血涂片发现血小板聚集,排除抽血因素,立即加入6.5 mg/mL阿米卡星,静置5 min后检测,并进行血涂片观察,如聚集消失,则进行结果报告;若仍聚集明显,可继续等待30 min后检测,发现血小板计数逐步上升,可继续观察至完全解聚,也可通过水浴加快此进程后进行结果报告;若血小板计数无明显上升且出现大量聚集时,用手工计数亦不能很好解决,此时只能通过对血片中血小板量进行估算,并在结果中注明后进行结果报告。由于阿米卡星在医院中使用普遍,且在临床实际工作中可减少患者重复采血,缩短报告等候时间,阿米卡星可作为处理EDTA依赖的假性血小板减少的一线方法在临床普及。 参考文献 [1] Berkman N, Michaeli Y, Or, R, et al. EDTA-dependent pseudothrombocytopenia: a clinical study of 18 patients and a review of the literature[J]. Am J Hematol, 1991, 36(3): 195-201. [2] Lippi U, Schinella M, Nicoli M, et al. EDTA-induced platelet aggregation can be avoided by a new anticoagulant also suitable for automated complete blood count[J]. Haematologica, 1990, 75(1): 38-41. [3] Gowland E, Kay HE, Spillman JC, et al. Agglutination of platelets by a serum factor in the presence of EDTA[J]. J Clin Pathol, 1969, 22(4): 460-464. [4] Sakurai S, Shiojima I, Tanigawa T, et al. Aminoglycosides prevent and dissociate the aggregation of platelets in patients with EDTA-dependent pseudothrombocytopenia[J]. Br J Haematol, 1997, 99(4): 817-823. [5] Zhou X, Wu X, Deng W, et al. Amikacin can be added to blood to reduce the fall in platelet count[J]. Am J Clin Pathol, 2011, 136(4): 646-652. [6] 周小棉, 巫小莉, 邓伟雄, 等. 丁胺卡那霉素抑制和解离抗凝剂依赖的假性血小板聚集作用研究[J]. 中华检验医学杂志, 2007, 30(3): 333-336. [7] 巫小莉, 周小棉, 邓稳德, 等. EDTA抗凝剂依赖性假性血小板减少症血小板计数研究[J]. 实用医学杂志, 2007, 23(4): 578-580. |
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