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| 作者：练宓1, 宓现强2 单位：1.上海理工大学医疗器械与食品学院, 2.中国科学院上海高等研究院 2012年《中国肿瘤登记年报》显示目前我国肿瘤发病率为285.91/10万。其中,胰腺癌恶性度极高,预后差,死亡率接近100%,在我国恶性肿瘤死亡率中排第6位,占全部癌症的4.54%[ 1]。由于胰腺位于腹腔深部,其癌症早期的临床症状通常不明显,大多数患者发现时已处于中晚期,并且超过95%的患者死于病理诊断后的5年内。当前上海市胰腺癌发病率正持续上升,总发病率为12.2/10万,已达到高发国家水平。胰腺癌早期诊断困难与肿瘤的形成过程、诊断方法的局限性以及标志物的选择有很大关系。 分子诊断学是近年来发展的新临床诊断方法,主要是对DNA、RNA和蛋白质的检测。miRNA近来受到很多专家学者的关注,目前已发现的人类miRNA共有1 048种(Sanger miRbase数据库20.0版),其数量之多,调节表达功能各异。并已有研究表明miRNA在胰腺癌中异常表达,是早期发生事件,可反映胰腺癌发生、发展及病理分级,这使miRNA可以作为新的生物标志物用于胰腺癌的早期诊断[ 2]。但由于miRNA序列较短,同源miRNA相似度高,所以对于其检测敏感性和特异性等方面都提出新的挑战。本文综述了胰腺癌当前临床诊断方法及诊断标志物,并对用于胰腺癌miRNA早期检测方法进行了探究。 一、 当前胰腺癌诊断方法及局限性 胰腺癌常规诊断方法有病史、查体、病理形态学诊断和影像学诊断等。病史和查体只能大概了解患者情况,而病理形态学诊断是确诊的唯一依据。影像学诊断方法主要有超声诊断、计算机断层扫描成像、核磁共振成像、经内镜超声扫描、内镜下逆行胰胆管造影以及磁共振胆胰管成像等[ 3]。 超声诊断价格低且没有射线辐射的危险,是目前胰腺癌诊断的重要方法之一,但易受肠胀气、腹水和患者体型等影响,对病灶<2 cm的胰腺病变检出率低;计算机断层扫描成像是胰腺癌疑似病例首选的影像学检查方法[ 4],与超声诊断相比,计算机断层扫描成像能更清楚的显示肿瘤大小、形态及与周围组织、血管的关系,能更好地判断有无血管侵犯,但其诊断的敏感性与病灶体积密切相关,对于<2 cm的病灶显示有较大的局限性,对早期胰腺癌的诊断意义不大;磁共振胆胰管成像可以了解肿瘤侵及范围,提供全面的胰胆管解剖图像,判断胰管梗阻程度,进行肿瘤术前分期和评价,具有无创、可对角度观察等优点,但显像较粗糙,对早期仅一期胰管形态细微变化的小胰癌的发现有一定的局限性[ 5];内镜下逆行胰胆管造影通过收集胰液或对胰管进行细胞学检查,其诊断准确度高,但属于有创检查,创伤性较大,且操作复杂,插管失败率较高,不宜作为首选检查方法[ 6];经内镜超声扫描能够通过内镜直接观察黏膜病变,诊断结果优于其它的影像诊断方法,然而该诊断是将探头插入消化管内,并不适合早期筛查[ 7]。 影像学诊断方法是临床肿瘤诊断的常规方法,但是影像设备由于其自身的种种缺陷,通常都是几种技术联合使用,并且由于其诊断敏感性低和特异性不高而多用于诊断高危人群,不能达到早期检测的目的。 二、 胰腺癌诊断标志物 2009年美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology,ASCO)提出了—些新的胰腺癌检测标志物[ 8]。蛋白类主要有糖类抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9, CA19-9)、PAM4、可溶性C3b、Dupan-2及Span-1等;DNA类有 K-ras;RNA类有唾液转录组标记物和miRNA等。但直到今天,临床上用于胰腺癌患者的诊断、复发以及预后的指标仍然只有CA19-9[ 9]。它是一种糖类肿瘤相关抗原,能够为单克隆抗体1116-NS-19-99所识别。CA19-9脏器特异性不强,可能存在于正常人的胰腺、胆道、胃、肠等组织中,在多种肿瘤中如胰腺癌、结肠癌、肝癌、胃癌、胆囊癌、肺癌以及乳腺癌中都可能有不同程度的升高。因此已经有许多学者认为血清CA19-9检测并不能准确地鉴别肝胆胰疾病的良恶性,目前ASCO也不再提倡将其作为用于肝胆胰恶性肿瘤诊断和确诊依据。诊断标志物的缺乏使很多研究人员正致力于寻求新的、特异性强的诊断标志物。 三、 胰腺癌新型分子标志物miRNA及其检测方法 1. miRNA与胰腺癌 miRNA具有广泛的基因调节功能,据统计miRNA调节了人类30%基因,参与了一系列生命活动,包括细胞增殖及凋亡、器官形成、造血过程、发育进程等,与肿瘤的发生、诊断、治疗和预后等有着密切关系,成为肿瘤研究的新热点。它相比于蛋白质等标志物表达异常出现的更早,对早期诊断更加有利。且miRNA很小,则能有效避免被内源和外源体液降解,因此miRNA相比于DNA和mRNA更加稳定。不同种类的肿瘤具有不同的miRNA表达谱,胰腺癌组织和血液中异常表达的miRNA具有细胞类型和疾病特异性,提示这些miRNA可以作为胰腺癌早期诊断的肿瘤标志物[ 10, 11, 12, 13, 14]。大量研究发现miRNA与胰腺癌发生、发展相关,其中表达上调的有miRNA-7d、miRNA-15b、miRNA-18a、miRNA-21、miRNA-31、miRNA-93、miRNA-100、miRNA-103、miRNA-107、miRNA-204、miRNA-221、miRNA-196a等;表达下调的有miRNA-155、let-7、miRNA-139、hsa-miRNA-96、hsa-miRNA-27、hsa-miRNA-148b、hsa-miRNA-216、hsa-miRNA-375等。miRNA与胰腺癌发病相关的、最常见表达异常的癌基因是 K-ras和 CyclinD1,抑癌基因是 p53、 p21、 p16、 p27 和 SMAD4 /DPC4。miRNA通过与靶mRNA的3'-UTR结合来发挥生物学效应。因此,若从已知的靶基因和预测的潜在靶基因中对miRNA的表达进行干预,可以达到早期预防的效果。进一步明确胰腺癌发生、发展的分子生物学机制,某些miRNA有可能作为治疗胰腺癌的目标靶分子。抗miRNA寡核苷酸类物质通过与致癌的miRNA互补,能够特异性抑制肿瘤组织中miRNAs的活性。此外,人为提高抑癌作用的miRNAs,如miR-217,可能会对肿瘤的治疗有益[ 15]。 2. 用于胰腺癌早期诊断的miRNA检测方法 在胰腺癌的早期检测中,除了标志物的选择和样本等的确定之外,检测方法也是提高检测特异性和敏感性很重要的一个方面。成熟miRNA片段小, 没有poly(A)尾巴, 家族成员间通常只有一两个碱基的差别, 并且在细胞中的表达水平普遍较低, 从而为miRNA检测建立带来了困难和挑战。科学家一直在探索可实现miRNA定量灵敏检测的新方法,如Northern blotting[ 16]、微阵列芯片原位杂交技术[ 17]、定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)[ 18]、滚环扩增法[ 19] 等。这些方法主要分为2类[ 20],一类是无需样本扩增基于探针直接杂交技术的检测方法;另一类是基于样本扩增反应的检测方法。 Northern blotting方法是一种直接检测的半定量方法,不需要对miRNA样本进行预扩增,如Wang等[ 21]应用Northern blotting技术分析了let-7i、miR-22、miR-143、miR-29b在胰腺癌组织细胞BxPC-1、Capan-2和Panc-1中的作用机制;以及Weiss等[ 22]用同样的方法探究了miR-10a对于促进胰腺癌细胞转移的机制;虽然Northern boltting是当前miRNA分析的标准方法,但其缺点是操作繁琐、耗时长、敏感性低,需要样本量过多等,且对RNase污染非常敏感。微列阵芯片是实现miRNA表达谱分析和多种miRNA高通量同时检测的主要技术,Volinia等[ 23]应用miRNA微阵列芯片技术研究了包括胰腺癌在内的6种肿瘤,监测了228种miRNAs的表达情况,结果发现有137种miRNAs可以很好地区别肿瘤组织来源;该方法的优越性在于可实现高通量、多组分同时检测,但微阵列芯片的制作和检测费用很高,芯片上可利用的样本体积很小,导致敏感性不高,获得数据偏差较大。原位杂交是用比色或荧光试剂等标记的核酸探针与细胞或组织中的miRNA进行杂交,通过显色或荧光成像检测miRNA的表达,可直观地展现miRNA的时空表达模式,如Obernosterer等[ 24]设计了用地高辛标记的锁核酸探针,此方法成功应用于多种组织和细胞内miRNA原位分析,也提高了miRNA的检测敏感性;然而由于miRNA序列较短,原位杂交技术需进一步改进,以提高杂交的亲和性,避免miRNA在杂交及随后的洗脱过程中丢失。滚环扩增法模仿生物体唤醒DNA分子滚环式复制的方式,以循环实现DNA的连续扩增,Yao等[ 25]设计了5'端磷酸化特异性引物,实时定量检测鼠组织中5种miRNA表达,该方法可区分组织let-7中8种miRNA,线性范围可达到7个数量级,并且let-7在胰腺癌中是明显表达下调的,结果提示其有望成为胰腺癌早期检测的分子标志物;但以miRNA为模板连接探针成环的效率低、特异性较差,需要电泳分离后利用放射性同位素检测。定量PCR是高敏感性定量检测miRNA的主要方法,反转录PCR检测是先把miRNA反转录成cDNA,然后再以cDNA为模板进行PCR扩增。目前主要的荧光定量PCR方法有荧光染料法和水解探针法。常用荧光染料分子式SYBR Green I,如Raymond等[ 26]首先利用其荧光定量,分析了12种组织样本中的6种miRNA;Jiang等[ 27]用SYBR Green I的PCR方法定量了人体胰腺、肺等组织中222种miRNA前体,并建立了一个在人类癌细胞株中的miRNA前体表达数据库。SYBR Green I的优势在于使用方便,不需设计复杂的荧光,也使检测方法变得简单,同时降低成本,但是它对PCR有一定的抑制性,并且荧光强度较低,稳定性差。水解探针以TaqMan探针为代表,Lee等[ 28]利用TaqMan探针分析了包括胰腺在内的多种人体组织细胞及肿瘤中多种miRNA表达谱,并对225种前体miRNA和成熟miRNA的表达谱进行比较。Jiang等[ 27]用同样的方法来区分几乎完全相同的let-7亚型家族成员。TaqMan探针的出现解决了荧光染料非特异性的特点,反应结束不需进行熔解曲线分析,缩短实验时间,但是其价格高,且只适合于一个特定目标,不便普及应用。此外TaqMan探针两侧的荧光基团与淬灭基团相距较近,淬灭不彻底使其本底高。由于成熟的miRNA分子只有20个碱基左右,序列较短,不能直接用PCR实现扩增反应,开发miRNA新型检测方法是当前研究者的重点。 分子信标检测技术是在上述两大类miRNA检测方法上发展的一种新型荧光定量技术[ 29],弥补了样本量需求大和步骤繁琐的缺陷,并且具有敏感性高、特异性强和可实时监测等优点[ 30],是能够实现对miRNA进行简便快速检测的新方法。目前已有许多尝试将分子信标技术用于miRNA检测的研究。如miRNA-21已被发现是一种具有高致癌性的miRNA,也是目前发现唯一在多种实体肿瘤及非实体肿瘤中高表达的miRNA。Baker等[ 31]通过分子信标探针对成熟miRNA-21和miRNA-21前体进行检测,研究结果表明分子信标可以区分成熟miRNA-21和miRNA-21前体,实现了miRNA的体外定量检测,因而有可能成为临床样本中成熟miRNA-21和miRNA-21前体评估的有力工具。Yin等[ 32]将LNA(Locked Nucleic Acid)分子信标作为探针,利用电化学的方法开发出了针对miRNA-21序列检测的高敏感性生物传感器,提高了分子信标检测的敏感性,并且解决了miRNA-21不稳定性和低丰度的难题。Stanford大学的Utz等[ 33]开发了一种用于miRNA分型的新方法,该方法采用等速电泳与分子信标相杂交的技术,其优点是便宜、简单、不需要扩增,只需要很少量样本(100 ng量级),有望取代miRNA检测常用的PCR或Northern Blotting方法。Yao等[ 34]把miRNA-155作为非小细胞肺癌诊断标志物,设计合成了miRNA-155分子信标,利用激光共聚焦显微镜和体视显微镜成像系统实现对miRNA-155的快速检测。 四、 展望 综上所述,胰腺癌恶性度高、预后差、死亡率高,临床通常依靠影像检测,所用诊断试剂盒特异性、准确性低,使其早期发现、鉴别诊断困难。鉴于miRNA可以反映胰腺癌的发生、发展及病理分级,并且其表达稳定无个体差异,可长期稳定存在,符合人们对于理想分子标志物的要求,可作为胰腺癌分子诊断标志物用于胰腺癌早期诊断。miRNA的检测对于胰腺癌的分子诊断具有重要意义,其分析方法正在不断发展,通过结合新的分析技术和新的探针材料,研究开发高通量、高敏感性、强特异性的miRNA检测方法,进而实现胰腺癌早期筛检诊断试剂盒的应用。 参考文献 [1] Siegel R, Naishadham D, Jemal A. 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