作者：段红蕾，胡娅莉
单位：南京大学医学院附属鼓楼医院妇产科
基于高通量基因测序的无创性产前检测（non-invasive prenatal testing，NIPT）可避免穿刺取样术带来的胎儿丢失、宫内感染等风险，同时具有检测通量高、周期短等优势，已逐步应用于临床[1]。在检测技术上，NIPT与母血清学筛查相比是对几种常见染色体非整倍体更精确的产前筛查方法,但尚不能作为诊断方法代替介入性产前诊断；在检测费用上，目前国内NIPT的价格为母血清学筛查的十余倍，不可能作为一线筛查技术广泛开展。NIPT的临床应用中必须恰当选择临床适应证，获益于其无创性、高效性优势的同时，必须强调NIPT可能带来的漏检风险和假阳性，以及合理的成本效益比。现将NIPT临床应用相关问题的研究进展综述如下。
一、NIPT检测范围及检出率
NIPT目前主要有鸟枪大规模平行测序（shotgun massively parallel sequencing，s-MPS）、靶向大规模平行测序（targeted massively parallel sequencing，t-MPS）以及基于单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）测序3种技术方法，其中以s-MPS应用最为广泛，目前国内临床应用的NIPT也均采用s-MPS技术进行检测。s-MPS技术对母血中总游离DNA片段进行测序与计数，再利用生物信息学技术进行数据分析，当某条染色体片段相对过量或不足时，判断为该染色体三体或单体。研究显示，胎儿游离DNA仅占总游离DNA的3%~20%，因胎儿染色体异常所导致的总游离DNA剂量变化很小，故需要对大量DNA片段进行深度测序以获得更多数据进行生物信息学分析，胎儿DNA比例越低，测序深度要求越高，检测成本越大[2]。
Benn[3]对基于s-MPS的NIPT临床检测效能作了回顾性分析，在0.19%、0.15%、0.32%的假阳性率下，21-三体、18-三体、13-三体的检出率分别为99%、97.6%和89.2%。13-三体的检测效能低于21-三体和18-三体，分析认为主要与13号染色体的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸和胞嘧啶脱氧核糖核苷酸含量较低有关，导致测序时产生偏差，因而生物信息学分析时需要建立更加合理的数学模型对其进行校正。此外孕有21-三体胎儿的孕妇血浆中胎儿游离DNA的含量会升高，而孕有13-三体胎儿的孕妇不出现这种现象，也降低了其风险评估的准确性。
性染色体异常是临床中常见的非整倍体异常，但是目前基于s-MPS的NIPT对于性染色体异常的检测效能不高。文献报道其对45,XO、47,XXX和47,XXY的检出率分别为83%、85%及83%[4]，对45,XO的检测敏感性约为94.4%[5]，远低于21-三体及18-三体，母体X染色体异常携带是导致检测效能低的重要原因之一。基于SNP的NIPT可更好地区分母体与女性胎儿X染色体片段DNA，对45,XO、47,XYY和47,XXY的检测准确性可提高至99.78%[5]，但该方法检测成本更高，在国内尚未开始临床应用。
虽然基于s-MPS的NIPT同时也对21、18、13号及性染色体以外的DNA片段进行测序，但其他染色体非整倍体在妊娠中后期相对少见，而且通常是嵌合体，其风险评估的准确性还缺少临床验证。理论上，如果增加测序深度，NIPT还可用于染色体片段微重复、微缺失等更精细的遗传学检测，但检测成本也将更高[6]。因而目前情况下基于s-MPS的NIPT的临床应用还仅限于21、18、13号染色体的非整倍体筛查。
二、影响NIPT检测结果的因素
1．母体染色体核型异常：
基于s-MPS的NIPT检测的是总游离DNA，无法区分母体DNA与胎儿DNA，因此如果孕妇自身染色体异常，将影响NIPT的检测结果。这在对X染色体进行检测时表现最为明显，孕妇为X单体或三体嵌合体时往往无明显临床表型且可正常生育，但可能导致NIPT检测中胎儿被误判为染色体异常。Wang等[7]对181例NIPT提示胎儿为X染色体非整倍体的孕妇本人进行了外周血染色体核型分析，结果显示8.6%的孕妇自身X染色体存在异常。
2．限制性胎盘嵌合体（confined placental mosaicism，CPM）：
孕妇外周血中的胎儿游离DNA来自于胎盘的滋养层细胞，CPM可能增加胎儿有效DNA片段的浓度导致假阳性结果，也可降低胎儿有效DNA片段的浓度导致假阴性结果。Wang等[8]报道了2例21-三体假阴性病例，即NIPT结果未见异常，但染色体核型分析显示胎儿为21-三体患儿，进一步检查发现胎盘组织为21-三体嵌合体，提示胎盘嵌合导致了NIPT与核型分析结果不一致。
3．胎儿游离DNA浓度太低：
胎儿游离DNA浓度也是影响NIPT检测准确性的重要因素，临床应用中当胎儿游离DNA比例低于3%~4%时，可能导致NIPT检测假阴性结果[9]。母血中的胎儿DNA浓度随孕周的增加而增长，一般在妊娠10周以后可占总游离DNA的4%以上[2]，因而目前建议只对妊娠12周以上的孕妇进行NIPT检测。研究表明，随着孕妇体重的增加，胎儿DNA浓度呈下降趋势，妊娠11~13周，当孕妇体重为60 kg时，胎儿DNA低于4%的孕妇仅占群体的0.7%；当体重为100 kg时，该比例为7.1%；当体重达160 kg时，55.1%孕妇血中的胎儿DNA浓度低于4%[10]。提示须警惕高体重孕妇NIPT易出现假阴性结果。
4．双（多）胎妊娠：
NIPT对双受精卵或者多胎妊娠的检测结果不如对单胎准确。如果双胎中的1个非整倍体胎儿死亡且未被发现，则可能导致假阳性结果，因为胎儿虽已消失，但胎盘组织仍可存在较长时间并向母血中释放游离DNA[3]。此外，孕妇患恶性肿瘤、近期有过异体输血、移植手术等也可对NIPT的结果造成影响，临床应用中应详细询问病史。
三、NIPT临床适应证
美国妇产科医师学会（American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG）、美国医学遗传学与基因组学协会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）、国际产前诊断协会（International Society for Prenatal Diagnosis，ISPD）等多个组织机构已发表声明，一致认为目前NIPT检测经济成本较高，而且检出疾病种类有限，尚不能代替经典的母血清学产前筛查，也不宜在低风险人群中广泛开展；但母血清学筛查高风险、高龄孕妇，是NIPT的临床适应证[11,12,13]。国际妇产科超声协会（International Society of Ultrasound in Obstetrics and Gynecology，ISUOG）也认为，孕妇血清学与颈项透明层（nuchal translucency，NT）联合筛查高风险是NIPT适应证，但对风险极高（≥1/10）的孕妇仍首先推荐介入性产前诊断而不是NIPT，因为在这部分人群中胎儿异常发生率高且21、18、13-三体仅占70%[14]。随着微阵列技术的发展，介入性产前诊断可能提供更多的信息。
此外，NIPT的临床适应证还包括有介入性产前诊断禁忌证（先兆流产、发热、出血倾向、感染未愈等），未做产前筛查或产前诊断但要求降低21、18、13-三体风险，超声提示NT增厚等。而对体重>100 kg的孕妇、双（多）胎妊娠、或孕周<12周的孕妇，由于NIPT结果可能受到影响，应谨慎应用。
国际指南及我国暂行技术规范均认为，当影像学检查怀疑胎儿结构畸形时，应建议介入性产前诊断而不是NIPT。有研究曾对586例因超声异常进行介入性产前诊断的病例进行回顾性分析，结果显示，超声异常指征的胎儿中，染色体异常发生率为9.9%（58/586），如果以NIPT代替介入性产前诊断，约35.6%的染色体异常漏检，漏检病例中95%以上可能有临床表型，胎儿染色体异常的漏检风险为10.1%[15]。必须强调NIPT不能代替超声检查，即使孕妇已接受过NIPT且结果为低风险，仍需接受详尽的超声胎儿结构筛查，如果超声提示结构异常，则需进行介入性产前诊断。
四、NIPT临床应用策略及效率
目前孕妇血清学产前筛查仍是一线筛查方案，NIPT可作为血清学筛查的一种有效补充，但如何将高成本的NIPT与价格相对低廉的血清学筛查结合，如何在合理的经济成本下提高筛查效率，必须充分考虑到本地区的出生缺陷构成及经济发展水平。国际上已有部分研究结合当地实际情况对NIPT临床应用策略进行了探讨。
Kagan等[16]对德国21 052例妊娠数据进行了回顾性分析，比较妊娠早期血清学筛查、NIPT、妊娠早期血清学与NIPT联合筛查对胎儿非整倍体异常的检出效率，结果显示，所有孕妇均接受妊娠早期血清学筛查时，在1/50和1/250的界值下，胎儿非整倍体异常检出率分别为81%和91%。如果所有孕妇直接采用NIPT检测21、18、13-三体及性染色体异常，检出率为88%。如先进行妊娠早期血清学筛查，中度风险孕妇再行NIPT，在高风险界值为1/50且中风险界值为1/1 000时，胎儿非整倍体异常检出率为94%；在高风险界值为1/150且中风险界值为1/500时，检出率为93%。提示在该人群中妊娠早期血清学与NIPT联合筛查，对胎儿非整倍体具有更高的检出效率。
英国Syngelaki等[17]研究发现，在妊娠早期血清学与超声NT联合筛查高风险（>1/100）的孕妇中，21、18、13-三体和性染色体异常分别占胎儿染色体异常的82.9%、8.2%、3.9%和5%。如果采用NIPT与血清学联合应用的产前筛查诊断策略，即对风险值>1/10者行介入性产前诊断，对风险值>1/2 500且<1/11者行NIPT，21、18、13-三体的检出率分别为97%、98%、98%，此外还可检出86%的性染色体异常和近一半的其他染色体异常，认为该筛查策略可提高染色体三体的检出率，但同时也会漏检部分其他染色体异常。
美国Cuckle等[18]根据其目前的收费标准，对几种不同筛查模式的成本效益进行了分析，包括所有孕妇均采用NIPT、酌情使用NIPT及以NIPT代替介入性产前诊断，结果认为，根据目前的NIPT、介入性产前诊断、医源性流产等现状，当对血清学筛查高风险中10%~20%的孕妇进行NIPT时，成本效益最高。英国Morris等[19]也对NIPT酌情筛查、一线筛查的成本效益进行分析，认为将NIPT作为一线筛查，虽然检出率高但成本也更高；而对母血清学产前筛查风险值>1/150的孕妇进行NIPT，可在不增加经济成本的情况下获得与母血清学产前筛查相近的检出率，但需进行介入性产前诊断的人数仅为母血清学筛查方案的7.1%。
我国提出的对临界风险孕妇进行NIPT，也是一种酌情应用NIPT策略，但需要通过试点单位的工作对筛查效率进行研究。由于不同地区的发展水平、出生缺陷的发生率及构成比不同，酌情筛查的界值还需在实际应用中不断修正。目前，NIPT的临床应用还是应由临床医生详细询问病史，告知NIPT的临床适应证及可能存在的风险，最终由孕妇知情选择。
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