最近20年，随着基因组测序技术的快速发展，细菌分子分型技术已经越来越普及。我比较幸运地于2006年进入了国内做细菌分子分型最好的团队，从事分子分型工作已8年有余。我来之家论坛是经BJYY陈sir介绍，在这里学习了很多知识，认识了很多朋友，感叹于微生物世界的美妙，感动于众多老师专家的知识的渊博。想想自己，工作8年有余，却从来没有将自己在工作中学到的知识、实际的经验和体会系统整理，所以想借助之家论坛这个平台，在今后的一段时间里，将自己对于细菌分子分型的一些认识和体会与大家分享和讨论。因为有些内容没有时间去翻文献资料逐条验证，而只是自己的记忆和认识，所以这里说的内容算是漫谈，有不妥之处，请大家指正！
医疗疾控领域病原细菌的操作主要有三个方面：病原、药敏、分子，而其中分子有分为分子鉴定和分子分型。分子鉴定比如PCR技术、杂交技术、芯片技术、测序等等；分子分型就是这里要说的内容，主要介绍脉冲电场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）、多位点序列分型（Multiple-Locus Sequence Typing，MLST）、多位点可变数目串联重复序列分型（Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis，MLVA）三种方法的分型原理、实验操作、数据分析、结果解释、实际应用。
细菌分子分型
生物分类自古有“界、门、纲、目、科、属、种”的公认原则，而“种”之下还有“群”“型”等概念，如许多细菌可以分为不同的血清群、生物型、噬菌体型等，而有些菌没有“种”的概念，或者说“种”和“血清群”是同 一个概念，因为它们在菌“属”下面直接是“血清群”，如沙门菌属、军团菌属。 传统的群和型的划分在我国历史上传染病的预防控制中起到了巨大的作用。举一个例子如下：70年代，我国霍乱防治专家高守一院士应用噬菌体一生物分型区分两类菌株（流行株和非流行株）。在防疫工作中，按两类菌株采取区别对待的防疫对策：集中力量加强对流行株的监测和控制，对非流行株则按一般腹泻病菌处理，不仅提高了防疫效果，而且节省了大量人力物力，在中国推广应用多年，并取得重大的经济效益和社会效益。经致病性研究表明，两类菌株的毒力、定居能力等均有显著不同；经染色体DNA酶谱分析表明，流行株具有特征性的染色体DNA酶谱，与非流行株的酶谱截然不同；经基因探针分子杂交实验证明，流行株与非流行株存在有与没有霍乱毒素基因的根本区别。这里的基因探针分子杂交实验（现在用PCR的方法）可以被认为是最早出现的一种分子分型的方法，可以将霍乱弧菌分为携带毒素基因（ctxAB+）和不携带毒力基因（ctxAB-）两大类（型），通过与噬菌体一生物分型方法比较，流行株都携带毒素基因（ctxAB+），而非流行株基本都不携带毒力基因（ctxAB-）。 在基因的概念引入微生物领域以后，人们陆续发明了多种分子分型方法，如核糖体分型（Ribotyping）、随机扩增PCR（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）等，这些方法曾经在细菌分型、基因多态性分型、种群结构分析、遗传进化分析等方面起到了一定的作用，但是实践证明，由于方法本身的局限性，这些方法重复性差、分辨力低，不适合用于细菌分型。重复性差的方法会导致本来应该相同的两株菌分成不同的型别，分辨力低的方法会导致应该有差异的两株菌分成相同的型别，而这两种情况都会导致错误的结果和结论。 评价一种分型方法的需要考虑以下几个方面：
1． 分型力( typeablity)： 指对被分析的每一菌株能够获得明确的、可用结果的能力。不可分型菌株是指那些没有结果或者结果不可用的菌株。
2． 可重复性( reproducibility) ：指用一种技术对同一菌株反复测试能够获得相同结果。技术因素和生物因素都可以影响可重复性。技术因素是指对同一菌株进行多次重复性实验而出现不同试验间的差异。生物因素是指细菌的某种测试特性存在生物学变异, 代表同一菌株的不同菌落的检测结果会有不同。
3． 分辨力( discriminatory power) ：指区分不相关菌株的能力。理想的情况是，每一个不相关菌株的结果都是独特的。可通过Hunter - Gaston Discrimination Index(D)计算两个不相关菌株被正确分为不同型别的概率来测量分辨力。在实际应用中, 当最常见的型别代表群体的比例小于5%时，此种方法在统计学上就可以应用了。
4． 可比性( typing system concordance) ：指不同操作人员，尤其不同实验室之间分型结果的可比性。
5． 其他非主要因素包括：操作难以程度、实验周期、实验通量、实验费用。 最后，也是最重要的，当一种分型方法作为流行病学调查工具时，还必须具备很好的流行病学相关性( epidemiololgic concordance)。流行病学相关性是指分子分型的结果与流行病学资料相符，易于解释。 就目前来说，综合考虑各方面因素，比较好的分子分型方法有PFGE、MLST和MLVA。然而也并不是这三种方法对所有的细菌都适用。一种细菌具体适用那种分型方法要看具体情况，因为有的细菌基因组变异大，有的细菌基因组变异小。并且在不同的层面（种或者血清群）进行分型不同的方法会获得不同的效果。比如，对于霍乱弧菌，在霍乱弧菌种的层面，MLST具有很好的分型效果，但是MLST对O1群产毒株的分辨力差，第七次大流行以来分离的O1群产毒株基本属于相同的MLST型别；而PFGE对于O1群产毒株的分辨力好，不同来源菌株（没有直接流行病学关联的菌株）基本具有不同的PFGE型别，而同一起暴发的菌株PFGE带型相同。所以，对于霍乱弧菌来说，MLST适合种层面的分型，分型整个霍乱弧菌种的种群结构特征，而PFGE适合用于O1群产毒株的流行病学调查。再例如，对于鼠疫菌，由于其基因组序列很保守，MLST和PFGE的分辨力均低，而MLVA的分辨力高，这是因为这三种方法检测的是不同的基因组元件，在鼠疫菌中，导致MLST和PFGE差异的元件变异度小，而导致MLVA差异的元件变异度大，所以鼠疫菌适合用MLVA来进行分型，可以用作分析种群结构以及作为流行病调查的工具。
