作者：上海交通大学附属第六人民医院内分泌代谢科 罗伊, 王从容
尿液检验因其获取简便、收集无创和可提供大量生理变化发展进程的信息, 被临床广泛运用。尿液中存在许多潜在的生物标记物, 包括代谢物质、细胞、蛋白、核酸等。这些生物标记物在检测药品的安全性、监测急慢性肾脏疾病和其他泌尿道的生理情况上具有突出的作用。为了发现新的生物标记物以及分析这些生物标记物的特异性和灵敏度, 除了依靠高精密的现代化仪器和技术 (蛋白组学、多肽组学、脂质组学、代谢组学),高质量的样本更是必不可少。因此, 建立高质量的尿液标本保存体系是开展代谢性疾病、肿瘤等重大疾病转化医学研究的重要环节。然而, 温度、酸碱度等许多因素对尿液中的生物标记物产生一定的影响。我们主要综述了外界因素对尿液检测指标的影响情况及环境因素对尿液代谢组和蛋白质组学分析的影响情况。
一、未添加防腐剂情况下的尿液存储稳定性
有报道[ 1]指出, 通常情况下, 尿液的存储不应当添加任何防腐剂。大量关于尿液中生物标记物存储稳定性的研究报道都对无防腐剂添加的尿液进行了实验研究。结果表明:不同温度条件下, 各种尿液检测指标的稳定性有所差异。
临床常见的尿液检测指标有尿肌酐 (creatinine, Cr) 、尿酸 (uric acid, UA) 、白蛋白 (albumin, Alb) 、总蛋白 (total protein, TP) 、尿钾 (K+)等。大量文献聚焦于对尿Cr、Alb存储稳定性的研究。尿Cr是临床重要检测指标。Cr存储的稳定性较好, 在4 ℃或25 ℃环境下, 将Cr存放30 d, 仍能保持稳定, 在55℃环境下2 d内能保持稳定[ 2]。但Cr存储的稳定性会受到pH值变化的影响。当pH值在0.5~7范围内时, 室温或是4 ℃条件下存放尿液1周, Cr量都没有显著变化;当pH=10时, 无论是室温或是4 ℃条件下, Cr值都有降低[ 3]。Cr在酸性环境中的稳定性是否优于碱性环境还有待于进一步研究。尿Alb是另一个与肾脏、心血管、糖尿病并发症等疾病相关的检测指标。在4 ℃或是20 ℃条件下若要保持尿液中的Alb浓度无显著变化, 存储天数相对较短, 最长只能存放1周[ 4]。另有许多蛋白质会受存储条件的影响, 如半胱氨酸蛋白酶抑制剂C (cystatin C, Cys C) 、肾损伤分子-1 (kidney injury molecule1, KIM-1) 、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 (neutrophil gelatinase associated lipocalin, NGAL) 等。Cys C是一种低相对分子质量的半胱氨酸蛋白酶抑制剂[ 5]。当Cys C/Cr比率在正常范围时, 尿Cys C浓度对于评价肾小球滤过率有重要价值[ 6]。Cys C作为常规的生化参数, 在大多数存储条件下能保持稳定[ 6, 7, 8]。室温下48 h内Cys C可以保持稳定, 4 ℃条件下1周内保持稳定[ 9]。KIM-1作为尿液中的生物标记物对于早期肾损伤诊断具有重要意义[ 10, 11]。当KIM-1储存于4 ℃或室温下, 24 h内不会造成明显降解[ 12, 13]。NGAL在肾损伤的早期诊断中也具有重要意义[ 14, 15]。4 ℃环境下储存7 d, 蛋白浓度的改变＜2％[ 16]。此外, 尿糖也是临床常用的检测指标。研究表明在4 ℃条件下24 h内尿糖能保持稳定[ 17]。综上所述, 室温或是4 ℃条件下尿液不宜存放过久。
相较于室温或是4 ℃条件下的存储, 尿液中多数生物标记物在低温冻存状态下能保持更长久的稳定。在－20 ℃冰冻状态下, Cr在6个月内可保持稳定[ 18],KIM-1存储12周也不会发生明显降解[ 12, 13],尿Cys C在1周内能保持稳定[ 9],尿κ轻链、尿λ轻链、血清类黏蛋白的量24个月内没有显著的改变[ 19]。转铁蛋白、α1微球蛋白在-20 ℃存放4周后浓度开始有明显变化[ 20]。但NGAL在-20 ℃存储时, 其浓度会产生明显变化[ 16]。此外, Alb在-20 ℃条件下存储的稳定性仍是一个有争议的问题。一方面有多个报道指出:在-20 ℃条件下, Alb能长期保持稳定。如Innanen[ 21]等指出尿液存储在-20 ℃条件下3周, 融化后离心前进行震荡 (倒置3~4下),则尿微量白蛋白 (microalbumin, mAlb) 浓度与冻存前保持一致。还有一些研究表明尿液在-20 ℃冻存1、2及1、2、4、5、6个月, Alb浓度前后差异无统计学意义(P>0.05)[ 4, 22, 23, 24]。另一方面有研究证实:在-20 ℃条件下, Alb不能保持长期的稳定性。尿液在-20 ℃环境下存放 (161 d、2个月、6个月、12个月或2年),Alb浓度显著下降[ 23, 25, 26, 27]。此外, 不同样品和相对蛋白浓度, 其稳定性也有一定差异。在-20 ℃环境下存储尿液6个月后, Alb浓度高的尿液其Alb下降率比Alb浓度低的尿液要低[ 27]。当Alb﹤30 μg/min时,-20 ℃环境下存放2、8、24周, Alb浓度明显下降;而Alb＞30 μg/min时, 任意储存温度、储存时间都没有对Alb浓度造成显著的变化[ 28]。综上所述, 冻存导致的Alb聚集 (可以通过震荡或是倒置来充分混匀样品, 恢复其原状) 在一定程度上是造成观测结果不同的原因所在。是否聚集的Alb会对溶液中的低丰度蛋白起到一个“下沉”的作用, 并不可逆转地降低其浓度, 至今还没有定论。Alb存储稳定性也会受到pH值的影响。存储前调节pH值＞8.0, 在-20 ℃条件下, 1年内Alb浓度无明显下降[ 29]。相反, 若在尿液中添加盐酸调节pH值至 2.3~2.5时, 会导致室温下尿Alb迅速降解[ 30]。可见尿液中Alb的降解具有时间及pH值依赖性。此外, Cys C、KIM-1的稳定性也受到pH值的影响。在pH=5或是更高的情况下, 尿液中的Cys C能保持稳定;虽然pH=4时, Cys C浓度会下降, 但若6 h内将pH值回调到≥5时, 其浓度会回升[ 9]。当pH值接近中性 (6~8) 时, KIM-1能保持稳定;当pH值呈酸性或碱性时 (4、5、9) 时, KIM-1不再保持稳定[ 31]。但pH值对尿液电解质的稳定性影响较小。尿液的酸化或是碱化并不改变尿中钙 (Ca2+)、镁 (Mg2+)的量[ 32]。即时测定24 h尿液中的Ca2+、Mg2+、PO43-并不需要添加酸性或是碱性物质[ 33]。考虑到pH值对尿液中多种蛋白质稳定性的影响, 在尿液存储前应当注意其pH值的大小。
相比尿液存放于-20 ℃条件下的研究报道,-80 ℃环境下尿液存放的稳定性研究结论比较一致。如Graziani等[ 26]、Lambers Heerspink等[ 29]检测尿样在-80 ℃环境下保存12个月的变化情况, 发现Alb浓度没有显著变化。KIM-1于-80 ℃储存达2年也不会对其造成明显降解[ 12, 13]。Cr在－70 ℃的冰冻状态下2年内可保持稳定[ 18, 34]。NGAL在-75 ℃存储13个月浓度变化不显著[ 16]。综上所述, 若想长期保存尿液, 更适合将其置于深低温状态下(-70 ℃或是更冷的温度) 。不仅由于众多研究表明尿液于深低温状态下冻存时其中的多数生物标记物的浓度变化相对较小, 更有报道指出尿液于-20 ℃冻存后溶解与于-80 ℃冻存后溶解相比, 冻融引起的物质含量下降更为显著[ 13]。但尿液中生物标记物也并非都会受冻融的影响造成大幅度地降解。Cys C反复冻融3次后测定其含量为冻融前的97.5%[ 9]。尿液 (正常Alb尿) 冻存于-30 ℃, 室温溶解, 反复冻融5次不会对尿Alb/Cr比率造成影响[ 35]。正常人或是糖尿病患者 (糖尿病患者分为3类:分别为正常Alb尿患者、mAlb患者、Alb尿患者) 尿液冻存在-20 ℃环境下6周反复冻融6次没有对Alb浓度造成明显影响[ 4]。关于Alb冻融的稳定性也有持相反意见的报道。Vangelisti等[ 25]发现反复冻融尿液会导致Alb浓度进行性下降, 特别是存储5个月之后浓度变化更为明显。总而言之, 为了检测或是研究的准确性, 在临床工作还是医学生物研究过程中都应尽量避免反复冻融样品, 即时检测其浓度。若需多次使用样品可以将其进行分装, 以减少冻融次数。
近年来, 随着组学技术的发展, 利用尿液开展代谢组和蛋白质组学分析已日益增多。众多研究利用蛋白质组学技术分析反复冻融是否会造成蛋白质谱的改变。Papale等[ 36]运用表面增强激光解析电离飞行时间质谱来观察室温下尿液蛋白质谱的变化情况。结果显示使用蛋白酶抑制剂复合物可增加其稳定性;并且蛋白质谱在冻融前后有微小差异, 但增加冻融次数 (≤5次) 并没有进一步影响蛋白质谱的改变。Fiedler等[ 37]使用磁珠来分离尿液中的尿肽然后使用基质辅助激光解吸电离飞行时间技术来描述多肽组的特征, 观察到冻融1次后尿液和新鲜尿液间蛋白质谱有显著改变, 但增加冻融次数 (3次内) 不会对蛋白质表达谱造成进一步的改变。另有研究[ 38]则发现尿蛋白在冻融4次后还能保持稳定;而冻融第5次后这些蛋白就无法被检测出来。可见, 反复冻融会对尿液蛋白质谱的检测造成一定影响。
Saude等[ 39]使用核磁共振氢谱来分析尿液中代谢物质的变化情况。研究结果表明将女性尿液于室温下存放4周, 若在存储前将其离心可以降低其中代谢物质的变化程度;若在存储前过滤尿样也可以降低其中代谢物质的变化程度, 但相比存储前离心的尿液其产生的变化程度更大。Erik等[ 39]将女性尿液在室温下存放4周, 观察苯酸盐和乳酸盐浓度在原尿和过滤后的尿液中的变化情况。结果显示原尿中苯酸盐和乳酸盐浓度在第一周显著升高, 在之后的3周升高缓慢;而在过滤后的尿液中苯酸盐和乳酸盐浓度在4周内没有明显变化。可以看出尿液存储前的预处理对于尿液存储过程中的代谢物质变化有显著影响。而关于存储条件对尿液中代谢物质的变化情况的研究则表明尿液 (男性尿液、女性尿液) 于室温下存放4周, 其中的代谢物质有显著变化;4 ℃条件下存放4周, 代谢物质浓度有轻微降低。
二、添加不同防腐剂后尿液存储稳定性
乙二胺四乙酸 (EDTA) 和亚硫酸氢钠是常用的尿液采集防腐剂。防腐剂的种类因测试方法、保存时间及样本运输条件的不同而不同[ 40]。当需要保存尿液中的尿胆素原时, 需要添加福尔马林;但在测定葡萄糖浓度时不能使用福尔马林, 因其会干扰定性的化学检测。检测葡萄糖时可以使用氟化钠作为防腐剂, 因为其可以阻止糖酵解的发生。可见, 防腐剂对于尿液的常见检测指标会产生一定的影响, 许多研究也证实了这一现象。将尿液存放于室温下6 h后可以明显观察到加入叠氮化钠后的抑菌效果[ 41]。尿液中细菌的繁殖会导致多种生物标记物的降解。将尿液于室温下存放4周, 若添加防腐剂叠氮化钠, 随着浓度的增加 (0.1、1、10 mmol/L),代谢物变化程度变小[ 39]。Tencer等[ 19]指出:IgG、HC蛋白在-20 ℃冻存时, 加入防腐剂 (溶液中包括氯化物、EDTA、三羟甲基氨基甲烷、叠氮化物) 能够阻止其降解。-20 ℃冻存条件下, IgG存储 1周后浓度开始下降[ 20, 42],但加入葡萄糖和牛血清白蛋白后可阻止IgG含量的下降[ 42]。有文献[43]显示, 在尿Alb正常或是有mAlb尿存在的胰岛素依赖型糖尿病患者中, 尿中含有葡萄糖的样本其IgG/Alb指数高于无葡萄糖含量的样本。推测葡萄糖可能有抑制IgG降解的作用。样本中加入300 mmol/L葡萄糖可抑制尿液中IgG浓度的下降 (如同时加入牛血清Alb则更佳) 。防腐剂的添加会影响尿液存储的稳定性, 在选择防腐剂时应考虑到检测物质的种类、保存时间等因素。
三、结语
总之, 在尿液储存过程中, 有些生物标记物易受存储条件的影响, 而有一些分子可以保持较长时间稳定。小分子物质、代谢物质和一些大分子物质之间的稳定性是有区别的。不同生物标记物的降解率是不同的, 而且很难通过生物标记物的分子大小进行预测。尿液中生物标记物受到各种外在因素的影响, 但对一些指标仍存在争议, 仍有必要开展尿液贮存稳定性的系列研究。
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