作者：苏州大学附属第一医院 国风
前列腺癌是欧美等西方国家发病率最高的男性恶性肿瘤之一，死亡率仅次于肺癌，位居第二位。据统计，2015年全美预计约有27540名患者将死于前列腺癌[1]。近年来我国随着人口老龄化和饮食结构等因素的变化，前列腺癌的发病率和死亡率一直呈上升趋势。2012年前列腺癌发病率达到9.92/10万，位居我国男性恶性肿瘤发病率的第六位。根据全国肿瘤登记中心2014年发布的最新数据表明，前列腺癌在全国城市恶性肿瘤发病率和死亡率排名分别列第八位和第十位。
随着前列腺癌特异抗原 （prostate specific antigen，PSA ）的检测及早期筛查的普及，部分前列腺癌得以早期诊疗。前列腺癌接受雄激素剥夺治疗时疗效显著，然而在治疗一段时间后，几乎所有患者雄激素非依赖性细胞比例上升，并最终由雄激素依赖性（androgen-dependent prostate cancer，ADPC）进展为高度恶性且广泛转移的雄激素非依赖性前列腺癌（androgen-independent prostate cancer，AIPC），即去势抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC）。近三年来，由于醋酸阿比特龙（abiraterone acetate，AA）以及雄激素受体拮抗剂恩杂鲁胺（enzalutamide 或 MDV3100）与多西他赛（docetaxel ）联合治疗等多项治疗方案的合理应用，转移性去势抵抗性前列腺癌（metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC）患者总生存期（overall survival，OS）获得显著改善[2,3]。
目前，临床上现有的生物学标志物以及传统影像学评估均缺乏对mCRPC患者临床疗效监测的特异性，同时由于存在骨等其他脏器的远处转移，如何对mCRPC患者治疗效果进行实时定量监测仍是临床上很棘手的问题。随着日益增多的新药及新的治疗方案的出现，对如何更加合理地设计和评估临床试验提出了新的挑战[4]。因此，探索新的有效的临床监测指标以便更好地进行前列腺癌治疗疗效评估以及预后的判断迫在眉睫。
一、 CTCs 概况
早在1869年，澳大利亚学者托马斯·阿什沃思（Thomas Ashworth）在一例转移性癌症患者外周血中发现了类似肿瘤的细胞，并首次提出循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）的概念。肿瘤细胞在早期就会自发地或因诊疗操作脱落进入血液循环系统。绝大多数脱落的肿瘤细胞短期内死亡，只有极少数具有高度活力和转移潜能的肿瘤细胞在血液循环系统中逃避机体免疫系统的监视而存活下来，相互聚集形成微小癌栓，并在多种因素作用下形成转移灶。血液循环中检测到CTCs并不意味着一定存在远处转移，但形成远处转移的几率大大增加。
发表在2004年《新英格兰医学杂志》的一项前瞻性多中心临床研究表明，治疗前CTCs数目可以作为转移性乳腺癌（metastatic breast cancer，MBC）患者无进展生存期（progress free survival，PFS）和OS的独立预测因子[5]。随后的多个临床研究证实，治疗期间的任何时间点存在CTCs数量增高均预示着疾病的快速进展和较差的预后。美国食品药品监督管理局（food and drug administration，FDA相继在2004年、2007年和2008年批准外周血CTCs检测的CellSearch系统用于转移性乳腺癌，结直肠癌和前列腺癌的预后评估、PFS和OS的预测。随着循环医学证据的不断出现和检测技术的飞跃，目前在美国，CTCs已经与常规检测方法相结合用于肿瘤诊疗的临床实践。在我国，由军事医学科学院江泽飞教授领衔的一项针对中国女性 MBC患者的多中心、双盲、前瞻性临床研究指出，CTCs数目可作为MBC患者PFS与OS的独立因素该研究同时表明，对于包括人表皮生长因子受体2（HER-2）阳性在内的各亚型乳腺癌，无论治疗手段如何，CTCs 计数均具有判断预后的价值[6]。随着在我国CBCSG004注册临床试验的完成，中国国家食品药品监督管理局（China Food and Drug Administration，CFDA）也已在2012年8月正式批准CellSearch循环肿瘤细胞检测与分析系统用于乳腺癌患者的预后分析。
CellSearch检测平台利用免疫纳米磁颗粒富集上皮来源的细胞。该免疫纳米磁颗粒包含一个纳米铁磁核心，包被了抗上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecular，EpCAM）特异性抗体，纳米磁颗粒会与血液中的所有表达EpCAM的细胞结合。在磁场的作用下，CellSearch系统对结合纳米磁颗粒的细胞进行捕获。最后，结合荧光染料的CD45抗体和细胞角蛋白（cytokeratin，CK）8，18/19抗体与核荧光染料DAPI（4，，6-diamidino-2-phenylindole）共同识别CTCs[7,8]。CTCs的评判标准为细胞不小于（4×4）μm2，有核细胞兼备EpCAM和CK表达，同时CD45表达为阴性，即EpCAM+CK+CD45-细胞[9]。CellSearch系统对血液中极其微量的细胞进行精准分析，每次只需7.5ml外周血，即可从400多亿的血细胞中检测到单个CTCs，可重复性、特异性和敏感性高，比CT和磁共振等影像学评估更早地预测肿瘤转移，比常规的血液学检测（如血清肿瘤标志物）具有更好的一致性和特异性[10]。
在健康志愿者外周血中掺入前列腺癌细胞株如LnCaP、DU145、PC-3或C4-2细胞并通过CellSearch系统捕获，对比观察前列腺癌患者外周血中捕获的CTCs。前列腺癌患者的CTCs体积明显小于前列腺癌细胞株细胞，同时CTCs核浆比增大，细胞形态更为狭长，CTCs之间的形态差异更为显著[11]。
另有研究发现，LnCaP细胞的CK表达水平高于前列腺癌患者CTCs，而两者雄激素受体（androgen receptor，AR）表达水平相近[12]。
在对mCRPC外周血CTCs的评判中，除了经典的所谓CellSearch-CTCs，又可以根据CK表达的强度和分布情况将这些EpCAM+CK+CD45-细胞进一步分成完整性CTC（intact CTC），颗粒状CTC（granular CTC），大片段 CTC（large tumor cell fragments，L-TCF），小片段CTC（small tumor cell fragments，S-TCF），大微粒CTC（large tumor microparticles，L-TMP）和小微粒CTC（small tumor microparticles，S-TMP）六类。其中，完整性CTC、颗粒状CTC、大片段CTC和小片段CTC具备细胞核，而大微粒CTC和小微粒CTC无细胞核[13]。
二、 外周血CTCs计数在前列腺癌中的临床意义
对于某些类型的实体肿瘤，治疗前后均可对肿瘤组织活检从而对肿瘤细胞进行分子特征评估并为分子靶向治疗策略的选择提供依据。而对于mCRPC，骨组织活检的困难性，使得外周血CTCs检测这种体外无创性“液体活检”的地位在临床上的意义更为突出。
早期的IMMC-38临床研究招募了276例mCRPC患者，其中231例进行了有效评估。根据基线CTCs数目，将患者分为CTCs数目较高（CTCs≥5个/7.5毫升外周血）和CTCs数目较低（CTCs<5个/7.5毫升外周血）两组。CTCs数目较高组的中位OS相比CTCs数目较低组显著缩短（11.5个月对21.7个月）。接受治疗后的中位OS，CTCs较高组仍然较CTCs较低组显著缩短（6.7-9.5个月对19.6-20.7个月）。基线CTCs数目如果在治疗后降低则与中位OS的延长具有相关性。与血清 PSA 变化相比，基线和治疗过程中任何时间点的CTCs数目均为较好的mCRPC患者生存期预测指标[14]。这项临床研究最终使得美国FDA于2008年批准了CellSearch系统用于转移性前列腺癌的评估。在对IMMC-38临床研究进行后序Cox回归分析表明，与死亡风险增加相关的基线变量包括高乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平、高CTCs数目、高血清PSA水平、低白蛋白和低血红蛋白。治疗后三个时点，4、8和12周CTCs数目变化与死亡风险呈强相关，而PSA水平的变化与死亡风险的相关性较弱或不相关。最有价值的生存预测因素是基线LDH水平和CTCs数目。再度分析强调使用CTCs作为连续性监测指标而非单一临界点值的重要性；并认为只要CTCs数量稳定或者减少且没有疾病恶化徵兆，就应维持原方案治疗[15]。
在SWOG S0421多西他赛加或不加阿曲生坦（atrasentan）的双盲Ⅲ期临床试验中前瞻性地验证了CTCs在238例mCRPC 患者多西他赛疗效监测并对OS预测中的价值。在基线以及第二个治疗周期前（d21）检测患者CTCs数量，分析从基线至治疗21天CTCs数量变化与OS、PSA水平以及实体瘤疗效评价标准（RECIST）之间的相关性联系。结果显示，基线患者每7.5ml外周血中CTCs的中位数是5，CTCs<5或≥5与患者基线PSA水平、骨痛、肝脏疾病、血红蛋白以及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平显著关联，并与PSA以及RECIST的变化关联性显著。基线时CTCs≥5相比CTCs<5的mCRPC患者中位OS显著缩短（13.0个对26.0个月）。基线CTCs数目以及基于多西他赛的方案治疗三周内CTCs数目的动态变化均是OS的独立预后指标。CTCs可以成为临床实践中指导以及优化治疗方案的早期指标之一[16]。对SWOG S0421双盲Ⅲ期临床试验进行后续研究发现，CTCs≥5的mCRPC患者中，CTCs端粒酶活性高与不良预后显著相关，即CTCs端粒酶活性也可能成为潜在的预测前列腺癌OS的独立预后指标之一[17]。
CTCs在mCRPC患者醋酸阿比特龙治疗中也起到了疗效监测的作用。在一项多中心的Ⅱ期临床研究中，应用醋酸阿比特龙治疗多西他赛化疗后的mCRPC患者。47例患者入组，其中34例进行了CTCs检测。79%的患者基线CTCs≥5，其中41%的患者在醋酸阿比特龙治疗后CTCs数目下降至<5[18]。2011年ACSO会议文摘报告，在COU-AA-301大型Ⅲ期临床研究中[19]，基线CTCs数目和LDH水平均为醋酸阿比特龙治疗的生存预测指标，并且治疗后 CTCs 数目的变化能够在治疗早期预测 OS。2014 年 ASCO 会议墙报交流中，Scher 博士报道了ELM-PC 5的Ⅲ期临床研究结果。根据CTCs数目和血清LDH水平可以将mCRPC分为低、中、高危三组。CTCs数目和血清LDH水平是基线和Orteronel治疗12周后OS的有效预测指标。
在对120例mCRPC患者的研究中也发现基线CTCs数目与OS显著相关。CTCs数目增高多见于存在骨转移的患者[7]。一项单中心临床研究发现，治疗前CTCs数目越多预示疾病进展。多因素分析提示CTCs≥5个可以作为疾病过程中所有时间点的独立预后指标，基线CTCs≥5个较CTCs<5个的患者中位OS缩短（19.5个月对30个月），CTCs≥50个较CTCs为5-50个的患者中位OS显著缩短（6.3个月对21.1个月）。治疗后，由基线CTCs≥5个减至5个以下比治疗后CTCs数目不变的患者OS延长[20]。另外，mCRPC患者的CTCs数量显著高于高风险局部进展前列腺癌（locally advanced high risk prostate cancer，LAPC）患者。LAPC患者和正常对照组CTCs数目之间无显著性差异。存在骨组织和其他器官远处转移的患者中位CTCs数目最高， 而仅有足底软组织转移的患者CTCs数量和正常对照组相近。CTCs数目和肿瘤负荷间无显著相关性，但与ALP和LDH水平呈正相关。CTCs数目高的mCRPC患者，同时存在PSA倍增时间缩短，高ALP和LDH水平以及低血红蛋白，患者疾病进展风险度高，OS缩短[21]。
多项临床研究试图阐明CTCs数目和临床特征之间的相关性，发现存在骨转移和血清PSA明显升高的前列腺癌患者中较易检出CTCs[22]。最新的一项研究发现，存在内脏转移和低水平血清PSA的前列腺癌患者生存期更短，并且检出的CTCs数目也较预计的少，可能的原因是该类前列腺癌细胞分化程度差，丢失了上皮细胞表面特征或存在EpCAM表达缺陷而造成了CTCs的漏诊[23]。总之，目前的多项临床研究基本证实了CTCs负荷与mCRPC患者预后的关系，CTCs数目可以作为临床判断疾病进展、预测OS以及判断疾病复发的独立分子标志之一[22,24-29]。
另外，对激素敏感性前列腺癌（hormone-sensitive prostate cancer， HSPC）的研究亦表明CTCs可以作为一个预后判断独立指标。在HSPC患者中，CTCs临界值设定在每7.5ml外周血中3个。通过多因素统计分析认为，基数CTCs数目可以在HSPC患者接受雄激剥夺治疗前预测患者进展为mCRPC的风险性[30]。也有报道将HSPC患者中CTCs的临界值设定为每7.5mL外周血中4个。CTCs≥4个相比<4个，HSPC患者OS缩短（24个月对45个月），而PFS更短（7个月对44个月）[31]。
除了CTC数目具有一定临床价值外，最新一项研究对CTC细胞核大小与临床预后进行了深入探讨。该研究将前列腺癌患者分为无转移，无内脏转移和具有内脏转移三类。采用NanoVelcro Chips技术检测CTC的同时对CTC细胞核大小进行分析并进而将CTC分成三大类，即大核（large nuclear）、小核（small nuclear）和极小核（very small nuclear）CTC。发现小核和极小核 CTC 在存在转移的前列腺癌患者中出现频率高，而极小核CTC在存在内脏转移的前列腺癌患者显著升高，建议将 CTC 细胞核大小也可以作为临床预后评估的生物标志物之一[32]。然而将CTC细胞核的大小用于临床评估仍需要大样本临床试验的验证[33]。有意思的是，CTC的纳米力学性能包括细胞弹性、变形性和黏性也有望成为前列腺癌患者新型的高效的生物标志物之一[34]。
值得注意的是，肿瘤细胞通过血液进行转移，以单个循环肿瘤细胞或是多细胞群体（CTC cluster ）的形式，最终在远端器官驻留。对CTC cluster也逐渐引起关注，CTC cluster源自单克隆肿瘤细胞群体而并不是肿瘤细胞血管内聚集现象。虽然与单个 CTC 相比， CTC cluster 在外周血液循环中数量更少，但其转移潜能较单个CTC强23-50倍。在转移性乳腺癌或前列腺癌患者中检出 CTC cluster 均预示着预后极差。发表在《Nat Methods》杂志的一种新型微芯片技术（cluster-chip）能够从未经任何处理的血液中捕获CTC cluster而不依赖于肿瘤特异性标记物。利用这种微芯片技术，从30%-40%的转移性乳腺癌，前列腺癌或恶性黑色素瘤患者血液中捕获到CTC cluster。后续经RNA测序，证实了这些CTC cluster的肿瘤源性，并在其中发现了组织来源的巨噬细胞[35]。在一项对64例前列腺癌患者的研究中，CTCs的检出率为 75.0%，同时CTC cluster的检出率为12.5%。在任意时间点检出CTC cluster与OS显著缩短相关，检出单个CTC患者的平均OS为930.1天而检出CTC cluster患者的平均OS仅为115.8天[36]。
三、 前列腺癌 CTCs 分子特征的研究进展
前列腺癌中，CTCs数目已被广泛研究并被确认是判断预后的指标之一。CTCs是脱落到外周循环系统的肿瘤细胞，很可能与原发或转移组织中的肿瘤细胞有着不一样的生物学行为，也很可能是导致肿瘤进展的“特殊分子”。目前，对 CTCs的研究已经从单纯的计数分析进展为对捕获到的CTCs进行更深层次的分子特征分析，旨在反映肿瘤的分子生物学变化。前列腺癌是一种由多种基因驱动的疾病，然而目前对于mCRPC的治疗选择多为经验性的。通过对CTCs进行分子特征分析或许会对未来前列腺癌的治疗起重要指导意义。事实上，对外周血CTCs已经成功完成了基因表达谱分析[37]。
AR在前列腺正常功能以及前列腺癌发生发展中发挥重要作用，雄激素去势治疗中AR信号通路的再次活化是进展为前列腺癌去势抵抗状态的潜在机制之一。事实上，前列腺癌患者存在继发性AR基因的突变，基因扩增或出现AR基因的剪接变异体[38,39]。在临床上实时获得高质量的组织标本非常困难，多数标本是在穿刺诊断或手术切除时获取的，反映的是去势敏感状态时AR基因情况，而发展成去势抵抗状态时的AR基因情况就不得而知了。靶向AR信号通路的治疗方案如醋酸阿比特龙和恩杂鲁胺也已经获得了美国FDA的批准，临床上更加期待能有效指导治疗的分子标志物。在mCRPC患者的CTCs中可以检测到存在于前列腺癌组织中的多种AR基因突变，如W741R，V757A，R874Y和T877A，以及AR基因的剪接变异体[40]。接受一线雄激素去势治疗的mCRPC患者CTCs中会发生AR信号通路由活化（AR-on ）向关闭（AR-off）转化的过程，而接受二线治疗的mCRPC患者CTCs中的AR信号通路的变化各异。出现AR活化（AR-on）细胞的增加和出现AR混合状态（AR-mixed）细胞均预示了预后不良[41]。在77例mCRPC患者CTCs中通过荧光原位杂交（fluorescence
in situ hybridization，FISH）检测到有38%的患者存在AR基因扩增[42]。对来源于mCRPC患者的CTCs进行全基因组扩增（whole genome amplification， WGA）并通过阵列比较基因组杂交（aCGH）进行分析，发现多数mCRPC患者CTCs中AR基因拷贝数显著增加[43]。AR分子特征的变化预示着AR活化状态的变化并最终影响着治疗方案的选择。定量监测CTCs的AR核表达有利于对mCRPC患者进行醋酸阿比特龙和恩杂鲁胺等内分泌治疗的疗效监测[44]。另外，前列腺癌患者中检出的CTCs，若存在AR剪接变异体7（AR-V7）预示着对恩杂鲁胺或醋酸阿比特龙耐药[45,46]。
TMPRSS2-ERG融合基因是前列腺癌中最常出现的基因融合类型。TMPRSS2-ERG融合基因通过与AR，多聚ADP-核糖聚合酶1（poly ADP-ribosepolymerase-1，PARP-1），核转录因子κB（NF-κB）和富含半胱氨酸分泌蛋白3（cysteine-rich secretory protein-3，CRISP3）等相互作用介导前列腺癌的发生发展。TMPRSS2-ERG融合基因阳性的前列腺癌可能更具侵袭性。TMPRSS2-ERG融合基因可作为醋酸阿比特龙治疗敏感性的指标之一，通过RT-PCR的方法在37%的mCRPC患者CTCs中可以检测到融合基因[47]。下一代测序为前列腺癌CTCs分子特征分析拓展了更大的空间，特别对于那些缺乏临床证据的患者，如PSA<1ng/mL。单核苷酸变异（single nucleotide variants，SNVs）已经被证实与前列腺癌预后相关，通过下一代测序已经在HSPC患者中被成功检测出[48]。采用前列腺癌的CTCs对与临床预后有直接相关的靶基因进行检测，发现SOD2，GPX1，AR，cyclin B和bFGF基因过表达，并与转移相关[49]。通过全外显子测序法对一例前列腺癌患者外周血CTCs，转移性淋巴结以及肿瘤原发灶九个不同穿刺点同时进行基因分析，发现在CTCs中检测到的73种突变类型有51种出现在配对组织中，吻合率达70%。在肿瘤组织样本中，检测到的与肿瘤转移相关的56种突变类型，其中73%在CTCs中检出[50]。随着用于CTCs检测的方法学不断优化，相信今后对CTCs进行单细胞水平的分子特征研究将会进一步深入，必将为我们认识前列腺癌转移的分子生物学机制提供新的视野。
CTCs表面CD117/c-kit的表达也被认为是前列腺癌诊断，进展和治疗敏感性的生物标志物之一[51]。采用基因芯片对CTCs≥5个和CTCs<5个的前列腺癌患者进行系统性分析，发现有282个基因存在差异性表达，这些基因分别在细胞代谢、信号转导，细胞生长和存活等功能中起重要作用。SELENBP1和MMP9基因组合是预测前列腺癌预后的最佳标签基因，两基因表达同时升高往往与较短的OS显著相关[52]。
四、 CTCs 检测的展望
目前，已经获得批准在临床应用的CTCs检测平台基于细胞EpCAM的表达。大约有30%-40%已经发生广泛转移的mCRPC患者外周血CTCs数目低或者根本检测不到。虽然CTCs数目低，但相对于CTCs数目高的广泛转移 mCRPC患者，预后相对改善。相似的情况也发生在转移性乳腺癌，尤其是侵袭性高的乳腺癌如三阴性乳腺癌、炎性乳癌或是已经存在脑转移的乳腺癌。CTCs的漏诊很可能是因为细胞本身的表型可塑性，使得基于EpCAM的CTCs捕获不够全面[53]。
上皮细胞间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮细胞获得迁移能力的有效方式，并在恶性肿瘤的浸润和转移过程中起重要作用。发生上皮间质转化的细胞由于缺乏EpCAM的表达造成了这部分CTCs的漏检[54,55]。在肺癌和胃肠道肿瘤中，CTCs漏诊的问题显得更为突出[56]。一些CTCs不仅表达上皮细胞的表面标志，同时也表达间质细胞和肿瘤干细胞的特性，充分说明了CTCs存在表型可塑性[57]。在前列腺癌患者雄激素剥夺治疗期间，间质细胞标志物在前列腺癌细胞中上调[58]。另外也有研究表明，EpCAM在29%的前列腺癌中表达下调，从而影响了CTCs的检出[59]。
目前正在开发和研究的技术也在向捕获EpCAM阳性并且EpCAM阴性的CTCs方向努力。例如，为了解决如何捕获正在EMT过程中的细胞，基于cadherin-11分子标志物的捕获技术已经成功研发，将进一步补充基于EpCAM表达的CellSearch检测平台。更全面深入地了解肿瘤的转移机制也将为今后CTCs捕获技术的发展奠定理论基础[8]。
多项临床研究业已证实，以严格判读标准定义的CTCs（即CellSearch-CTCs）数目和前列腺癌患者的PFS和OS相关，然而多数临床研究后期并没有再根据严格或相对不严格的判读标准分别对CTCs计数，并进一步与患者预后之间的相关性进行分析。通过多变量分析发现L-TCF，相对不严格的标准判读的S-TMP与严格标准判读的CellSearch-CTCs一样均可以作为患者预后判断指标[13]。在我国，随着CellSearch循环肿瘤细胞检测与分析平台在各大医院的相继建立，一方面确立CTCs的判读标准，另一方面不断提高医师进行CTCs判读的技术水平均迫在眉睫。
综上所述，CTCs检测已经在多种实体瘤中进行了广泛研究和应用，在前列腺癌的临床应用也是非常合适的。前列腺癌一旦转移，致死率极高。由于转移性前列腺癌的不可治愈性以及不可预测性导致对局灶性前列腺癌的过度治疗。对肿瘤转移的生物学行为进行更好的预测以及认识有利于对前列腺癌进行有效治疗。在mCRPC中，血清PSA水平的变化往往缺乏准确性，不能作为有效的临床试验观察终点，临床医生只能通过症状、影像学评估甚至骨组织活检等手段来判断疾病的进展或者评价疗效。CTCs检测作为一种非创伤性的新型体外诊断方式，具有实时监测功能，可以作为疾病预后的独立预测因子并可以作为临床试验观察终点和中间终点的可靠指标，并对制定有效的个体化治疗方案提供帮助。
