出凝血检验项目种类繁多, 方法各异, 其中初筛试验是临床最常用的检测项目之一, 确认试验对疾病诊断发挥决定性作用。做好出凝血检验的质量监控和质量改进工作对出血性疾病和血栓性疾病的诊断、治疗监测意义重大。卫生部临床检验中心通过分析调查问卷和全国室间质量评价参加实验室的反馈信息了解到, 临床实验室在出凝血检验项目的方法选择、性能验证以及分析前质量控制等方面的问题较突出, 拟通过制订和应用行业标准, 逐步达到规范操作、监控质量和改进质量的目的。
一、国家卫生标准委员会临床检验标准专业委员会与卫生行业标准制订
卫生部临床检验标准专业委员会成立于1996年, 2013年12月18日国家卫生和计划生育委员会文件“ 国卫法制发[2013]45号” 发布通知, 将标委会换届为第七届国家卫生标准委员会临床检验标准专业委员会, 负责临床实验室管理(质量、安全、信息等)、临床检验技术(参考系统、参考区间、重要常规检验等)和检验项目临床应用等相关标准的制订。临床检验标准专业委员会秘书处的挂靠单位为卫生部临床检验中心。
二、出凝血检验相关卫生行业标准的制/修订情况
已发布的出凝血检验相关行业标准有8项, 包括WS/T 406-2012《临床血液学检验常规项目分析质量要求》、WS/T 359-2011《血浆凝固实验血液标本的采集及处理指南》、WS/T 344-2011《出血时间测定要求》、WS/T 224-2005《血小板计数参考方法》、WS/T 342-2011《红细胞比容测定参考方法》、WS/T 407-2012《医疗机构内定量检验结果的可比性验证指南》、WS/T 347-2011《血细胞分析的校准指南》和WS/T 220-2002《凝血因子活性测定总则》; 待发布1项《D-二聚体定量检测质量控制指南》; 2014年立项修订1项《血浆凝血因子活性测定》。
三、出凝血检验部分卫生行业标准介绍
(一)行业标准WS/T 406-2012《临床血液学检验常规项目分析质量要求》
1. 制订依据和方法 参考美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)指南[1, 2], 利用全国室间质量评价参加实验室的室内质控和室间质评数据进行模拟研究, 横向比较其它国家的质量指标, 以召开讨论会的形式, 多次征求检验和临床专家、企业技术专家、认可机构负责人的意见, 反复修改经审批后发布。
2. 适用范围 规定了临床血液学检验常规项目(全血细胞计数和凝血试验)的分析质量要求及验证方法, 适用于使用血液分析仪和血凝仪的临床实验室、室间质评机构或体外诊断企业等。
3. 该标准规定的凝血实验分析质量要求 (1)批内精密度: 以连续检测结果的变异系数为评价指标, 批内精密度应符合表1的要求; (2)日间精密度:以室内质控在控结果的变异系数为评价指标, 日间精密度应符合表2的要求; (3)线性(适用于FIB检测项目):线性回归方程的斜率在1± 0.05范围内, r≥ 0.975, 在仪器说明书规定的线性范围内应满足要求; (4)正确度:以偏倚为评价指标, 要求FIB的偏倚≤ 10%; (5)准确度:以总误差为评价指标, 用相对偏差表示, 要求PT≤ 15.0%、APTT≤ 15.0%、FIB≤ 20.0%。
(二)行业标准WS/T 359-2011《血浆凝固实验血液标本的采集及处理指南》
1. 制订依据和方法 参考CLSI指南[3, 4], 结合国内实际情况, 根据专家意见反复修改。
2. 适用范围 规定了血浆凝固实验血液标本的采集及处理要求, 适用于采集患者标本和制备血浆用于血浆凝固实验的机构。
3. 主要内容 (1)标本采集:①通常使用真空采血系统采集血液, 该系统由无菌采血针、持针器以及加入抗凝剂的真空采血管组成, 如由不同制造商提供, 应检查并评价配套使用的效果; 如使用一次性塑料注射器, 推荐使用注射器的体积≤ 20 mL; 根据采血量、患者年龄以及静脉粗细程度选用不同型号的针头。②用于血浆凝固实验的抗凝剂应为10^5~10^9 mmol/L(3.1%~3.2%, 通常为 3.2%)的枸橼酸三钠水合物(Na3C6H5O7· 2H2O); 血液与枸橼酸钠抗凝剂的体积比为 9∶ 1; 血细胞比容≥ 0.55 L/L(55%)时, 需对血液中枸橼酸盐的终浓度进行调节。③采血过程要求压脉带捆扎时间不超过1 min。④在特定情况下, 可使用血液采集系统或注射器从血管通路装置采集血液标本, 但应避免肝素污染和标本稀释。⑤应使用采集的第2管血液用作凝血标本检测。(2)标本运送:标本采集后应减少运送环节并缩短转运时间, 应由经过培训的专人负责运送且有制度约束。使用气动传输方式运送标本时, 应确认剧烈震荡、温度等因素是否对检测结果产生影响。(3)标本接收:申请单与试管标签上的信息应一致。从采集标本到实验室收到标本的时间间隔应符合实验室的规定。应制定鉴别不合格标本的标准, 如标本有凝块、抗凝剂使用错误或采血量不够(与标示量相差> 10%)时, 应拒收标本, 如标本不合格, 实验室应立即与临床联系, 以进一步采取措施。(4)标本处理:将装有标本的带盖试管在规定速度和时间条件下(室温、1 500× g、不少于15 min)离心, 以得到乏血小板血浆(血小板计数< 10× 10^9/L)。离心机应使用甩平式转头。标本有溶血时不应使用。使用光学原理的检测仪器时, 当标本有黄疸、脂血或影响光散射强度的干扰物质时, 应使用替代方法。每6个月或在离心机维修后, 应验证离心力。(5)标本保存:不同检测项目的标本保存时间有差异, 通常应在标本采集后1 h内分离血浆, 4 h内完成检测。
(三)行业标准《D-二聚体定量检测的质量控制》(待发布)
1. 制订依据和方法 通过问卷调查和质控物检测调查, 了解D-二聚体检测现状及问题, 参考CLSI指南[5], 提出质量控制关键环节的要求, 多次以会议形式征求检验专家、临床医生和企业技术负责人的意见, 反复修改完善后形成此稿。
2. 适用范围 规定了D-二聚体定量检测的质量控制和性能验证要求, 适用于不同类型的检测实验室。
3. 主要内容 (1)方法选择:酶联免疫分析法检测结果可靠、敏感性高, 可作为其它常规检测方法的比对标准。微粒凝集定量检测法是血液凝固分析仪主要采用的检测方法, 操作简便、快速, 可满足常规和急诊标本的检测要求。半定量乳胶凝集法检测速度快, 适用于高浓度水平D-二聚体检测(如弥漫性血管内凝血、溶栓治疗等), 但不适用于静脉血栓栓塞症的排除诊断。床旁检测可快速得到检测结果, 但应与可靠的检测方法进行结果比对, 不适用于静脉血栓栓塞症的排除诊断。(2)性能验证:检测系统用于临床前应进行性能验证, 包括精密度、线性和正确度等; 仪器在使用过程中, 每年应对性能进行评审, 评审不合格时应进行性能验证。①批内精密度要求:批内精密度以连续检测结果的变异系数(coefficient of variation, CV)为评价指标, 批内精密度应达到试剂厂商说明书的要求, 同时至少应符合正常质控品或血浆标本检测结果CV≤ 15%和异常质控品或血浆标本检测结果CV≤ 10%的要求。②日间精密度要求:日间精密度以室内质控结果的CV为评价指标, 日间精密度应达到试剂厂商说明书的要求, 同时至少要求CV≤ 15%; 当D-二聚体用于静脉血栓栓塞症排除诊断时, 临界值水平检测结果的日间精密度应≤ 7.5%。③线性要求:线性回归方程的斜率在1± 0.05范围内, r≥ 0.975, 在试剂厂商说明书规定的线性范围内应满足要求。④校准及正确度验证:依照厂商说明书规定的程序进行校准, 可选择配套校准物进行校准, 也可使用预定标模式进行校准, 可使用厂商提供的配套校准物或参加室间质量评价进行正确度验证。⑤实验室内部结果可比性:同一机构内使用多个检测系统时, 应尽可能选用同一品牌的检测系统; 实验室使用同一品牌的多个检测系统时, 应定期进行结果比对(至少半年1次); 至少使用20份临床标本(正常和异常标本各10份)进行比对, 高浓度水平标本的比对偏差≤ 10%, 低浓度水平标本的比对偏差≤ 20%。(3)参考区间及验证:特定健康人群的D-二聚体结果偏高(如老年人、孕妇和围产期妇女), 建议单独建立参考区间并标注于检验报告中。验证参考区间时, 至少选择20名健康个体(男女各半), 采集静脉血进行检测, 结果超出参考区间的数量不超过10%(2个数据)表示验证结果符合要求, 否则应重新选择20名健康个体再次进行验证。确认验证结果符合要求后, 可使用参考区间。(4)D-二聚体检测结果用于静脉血栓栓塞症排除诊断的要求:①验前概率:依据患者临床症状和体征, 临床医生应通过标准化的临床评分规则(如Wells和Geneva评分规则)确定患者发生静脉血栓栓塞症的可能性。对于低或中度验前概率的患者, D-二聚体检测结果可用于排除静脉血栓栓塞症, 当患者验前概率较高时, 不适合使用D-二聚体检测结果进行排除诊断, 需进行影像学检查以明确或排除诊断; ②精密度:使用D-二聚体检测进行静脉血栓栓塞症排除诊断时, 临界值水平检测结果的日间不精密度应≤ 7.5%; ③敏感性和阴性预测值:要求检测结果在临界值浓度水平处的敏感性≥ 97%, 阴性预测值≥ 98%, 阴性预测值95%可信区间的下限≥ 95%; (5)关于静脉血栓栓塞症排除诊断的临界值:建立静脉血栓栓塞症排除诊断的临界值时, 被检测D-二聚体的疑似静脉血栓栓塞症患者应同时使用影像学检查明确或排除诊断, 对于排除静脉血栓栓塞症的患者, 应至少在3个月内对其进行跟踪随访, 以确认检测结果确实为阴性。试剂厂商应提供多中心研究得出的排除诊断临界值, 且该临界值经产品注册审批部门批准适用于相应检测系统, 实验室使用临界值前宜进行评审。(6)结果报告:D-二聚体定量检测结果有FIB等量单位(FEU)和D-二聚体单位(DDU)2种报告方式, 实验室宜使用厂商推荐的报告方式, 不宜进行不同报告方式的转换。更换不同种类的试剂后, 应注意报告方式、参考区间、排除诊断临界值等变化, 并与临床进行沟通。静脉血栓栓塞症排除诊断临界值可能与参考区间不相同, 当D-二聚体的检测目的为排除静脉血栓栓塞症时, 若静脉血栓栓塞症排除临界值与参考区间上限值不同, 宜报告临界值; 检测目的不明确时, 建议同时报告参考区间和临界值。
参考文献
[1] Clinical and Laboratory Stand ards Institute. Validation, verification, and quality assurance of automated hematology analyzers[S]. H26-A2, CLSI, 2010.
[2] Clinical and Laboratory Stand ards Institute. Protocol for the evaluation, validation, and implementation of coagulometers[S]. H57-A, CLSI, 2008.
[3] Clinical and Laboratory Stand ards Institute. Collection, transport, and processing of blood specimens for testing plasma-based coagulation assays[S]. H21-A5, CLSI, 2008.
[4] Clinical and Laboratory Stand ards Institute. Procedures for the collection of diagnostic blood specimens by venipuncture[S]. H3-A6, CLSI, 2007.
[5] Clinical and Laboratory Stand ards Institute. Quantitative D-dimer for the exclusion of venous thromboembolic disease[S]. H59-P, CLSI, 2010.
