摘要：人类白细胞抗原（HLA）参与机体免疫应答并约束免疫细胞间相互作用，尤其与疾病易感性和药物不良反应等密切相关，在机体与药物相互作用之间起着重要的调节作用。近年研究发现，某些HLA等位基因与药物不良反应存在强相关，甚至成为疾病辅助诊断的关键标志物，对指导临床个性化用药起到关键作用。本文就HLA基因分型与药物不良反应及个性化用药的相关研究及检测技术进展做一综述。
关键词： HLA；基因分型；个性化用药；卡马西平；别嘌呤醇
药物不良反应(adverse drug reactions，ADRs)是长期困扰医药学界的一个难题。联合国世界卫生组织统计：全球死亡患者中，1/3是死于不合理用药而非自然疾病本身。我国卫生部药品不良反应监察中心的数据显示：住院病人中，每年约有20万人死于ADRs；家庭用药不良反应需要住院治疗的病人则高达250万人[1]。因此个性化用药及用药安全已成为医学界的热点问题。利用先进的基因检测技术筛选出最适合的药物，提高药物疗效，降低毒副作用，减轻病人的痛苦和经济负担，是未来个体化医疗的大势所趋[2]。
ADRs原因复杂，近年来，研究者们逐渐认识到人类白细胞抗原（Human Leucocyte Antigen，HLA)等位基因与多种药物所致的ADRs之间有强烈的关联性，直接参与致病机制[2]。
1. HLA概述
近年来，某些药物诱发ADRs的遗传学基础成为个性化用药领域的研究热点。研究发现HLA基因的单核昔酸多态性(SNPs)变异与多种ADRs相关[1-3]。HLA是人类白细胞抗原，也称主要组织相容性抗原（MHC）。HLA位于人类6号染色体短臂上，在3600kb范围内含有224个基因座，每个基因座又含多个等位基因。HLA基因根据其结构和功能的差异可分为三类。Ⅰ类基因区位于着丝点的远端，主要包括HLA-A、B、C三个位点；Ⅱ类基因区位于着丝点的近端，是结构最为复杂的一个区，主要由DR、DQ、DP三个亚区构成；Ⅲ类基因区含有编码补体成分C2、C4、B因子及TNF、热休克蛋白和21羟化酶的基因[3-4]。
HLA功能多与免疫相关，是目前所知人体最复杂的遗传多态系统，具有明显的种族特异性。已经证实，HLA复合体中存在控制免疫应答的基因，参与约束免疫细胞间相互作用。这表示HLA涉及生命活动的各个水平及多个方面，尤其与疾病易感性、药物不良反应等密切相关，在机体与药物相互作用之间起着重要的调节作用[4]。
2. HLA与个性化用药
ADRs的临床表现很多，皮肤药物不良反应（cutaneous adverse drug reactions，cADRs）最常见。cADRs分为温和型的“皮疹”和致死型的“重症药疹“。”重症药疹“包括SJS（Stevens-Johnson syndrome，史提芬强生综合症，重症多形红斑型，病死率5%-10%）、TEN（Toxic Epidermal Necrolysis，毒性皮肤坏死，大疱性表皮坏死松解型，病死率30%-40%）和剥脱性皮炎型[5]。
研究发现，HLA等位基因型与此类疾病强相关，尤其是HLA-B位点。在亚洲，抗癫痫药物是引起SJS的最常见原因，其中卡马西平是引起SJS的主要药物，占19％～35％。在中国大陆别嘌呤醇、卡马西平和阿莫西林等B内酰胺类抗生素分别是前三位最常见的cADRs诱发药物[6,7]。表-1列数了引起药物不良反应相关的药物及其相关的HLA等位基因[4]。
2.1 卡马西平
卡马西平是一种抗癫痫药物，可治疗全身强直-阵挛性癫痫，缓解与三叉神经痛有关的疼痛，预防躁狂忧郁症。据世界卫生组织和卡马西平制药商收到的上市药品不良事件报告，卡马西平会引起SJS/TEN，尤其是含HLA-B*1502、HLA-A*3101等位基因的患者更容易发生。研究发现汉族人群中SJS/TEN的发生与HLA-B*1502、HLA-A*1101、Cw*0801和DRBl*1202有很强的相关性。其中，HLA-B*1502在SJS患者中的阳性预测值高达94%，阴性预测值高达100％[6-8]。基于大规模研究数据，2009年8月，美国食品药品管理局（FDA）对医务人员发出警告并建议对所有的亚裔人群在使用卡马西平前进行HLA-B*1502等位基因分型检测。近期中国食品药品监督管理局（CFDA）也发出警告，并建议在开始卡马西平治疗前筛查HLA-B*1502等位基因[8,9]。
2.2 别嘌呤醇
别嘌呤醇是主治高尿酸血症及其并发症痛风病的药物。因其具有无可媲美的多重降尿酸机制，加之药价低廉、用药方案简单易行等，在临床具有无可替代的重要性。但该药存在较高的cADRs发生率，且其程度往往较为严重，致使其在临床运用中受到了极大的限制[2]。HLA-B*5801与别嘌呤醇所致SJS／TEN之间的关系首先在台湾被报道，随后在日本、泰国、韩国以及欧洲多个人群中被证实。2010年，国际组织相容性专题研讨会(IHWC)报道世界不同人种HLA-B*5801的平均携带率有所不同，非洲人2%~4%，白种人1%~6%，亚洲印度人3%~15%，华人8.8%~10.9%。因此亚裔人群发生别嘌呤醇相关皮肤药物不良反应的风险更大[8-9]。2008年我国台湾地区已经对于准备使用别嘌呤醇的患者实施该基因的检测，对于结果阳性的患者禁止使用。2013年，中华医学会内分泌学会关于“高尿酸血症和痛风治疗中国专家共识”中明确提出别嘌呤醇相关的严重超敏反应与白细胞抗原HLA-B*5801密切相关，建议亚裔人群在使用别嘌呤醇前，进行HLA-B*5801基因筛查[9-10]。
3. HLA分型检测技术发展
分子生物学技术的迅猛发展给HLA基因分型研究注入了新的活力。目前，HLA基因分型主要技术有流式荧光技术（xMAP)、直接测序分型（SBT）、基因芯片技术和氨基酸残基配型标准分型技术，以及限制性片段长度差异分析（RFLP）、PCR-RFLP和PCR-SSCP等，后面3种方法因其操作繁琐、结果解释复杂，不适合临床推广。国际组织相容性专题研讨会(IHWC)选择的分型方法是SBT、序列特异性引物聚合酶链反应技术（PCR-SSP）和序列特异性寡核苷酸探针聚合酶链反应技术（PCR-SequenceSpecific Oligo，PCR-SSO）。其中PCRSSO是目前临床上最常用，认可度最高的HLA基因分型技术。
3.1PCR-SBT
PCR-SBT直接对PCR扩增的HLA各亚型等位基因片段进行测序，通过分析DNA序列信息可直接得到基因型。该方法分辨率高，可大规模进行，精确度好，能发现新的等位基因。但其对仪器要求很高，数据分析复杂，需专业人员操作分析，且无法对杂合子进行准确的等位基因分型[9]。目前一般实验室难以达到要求。
3.2PCR-SSP
PCR-SSP是根据HLA核苷酸碱基序列多态性和已知DNA序列，设计一系列等位基因特异性序列引物，通过特定的PCR反应体系扩增各等位基因的型别特异性DNA片段，最后通过电泳直接分析带型决定HLA型别。该方法优点是仪器要求低，分辨率可从低到高和成本低。缺点是需要设计大量引物，对样本DNA用量大，不易自动化，临床应用不方便，不能检测新的等位基因。此方法多用于单一位点的基因分型如B*5801等高分辨度分型，很难区分不同HLA型别。
3.3PCR-SSO
PCR-SSO先对HLA的多态区域进行扩增，在扩增过程中标记PCR产物，针对PCR扩增产物根据碱基配对原则设计系列寡核苷酸探针固定在固相载体上，最后将PCR产物与膜上的探针杂交，显影，根据信号判断结果。PCR-SSO分型技术是目前最常用、认可度最高的DNA分型技术。为此IHWC对PCR-SSO技术的实验条件和探针均制定了统一的标准。
为了提高该技术的自动化和标准化，2000年3月，美国ONELAMBDA公司开发出针对美国国家骨髓库（NMDP）分型精密度要求，并基于流式荧光技术的HLA PCR-SSO分型产品。HLA-DNA分型检测SSO试剂利用流式荧光技术及SSO对HLA-I类及HLA-II类基因进行分型。首先，利用特异性引物对双链DNA进行多重扩增；随后，PCR产物经生物素标记并经过变性及中和反应，使单链DNA与编码微球上交联的特异性探针互补结合；最后，信号经SAPE标记放大，经由Luminex 200检测，导出数据并与已公布的HLA基因分型模型比较，获得HLA基因分型结果，如图-1所示。从临床角度来看，该系统具有较为明显的优势，可同时区分不同型别，如HLA-A、B、C、DR、DP、DQ分型实验可以在一个单独的管内完成数据采集，时间迅速，省时省力，比较适用于HLA等位基因高分辨分型检测，具有灵敏度高、特异性强、需样本量少等特点。
目前国际上仍缺乏准确性好、安全性高的手段来预测ADRs，随着相关HLA危险等位基因的发现，将HLA分型检测运用到个性化用药及临床预防性筛查的尝试已逐渐获得重视，对药物不良反应的预测无疑具有很大的临床及经济学价值。鉴于卡马西平及别嘌呤醇在临床的重要地位和它们所致cADRs的高发率、危害性，分析两类药物相关HLA等位基因型，并在此基础上进行基因筛查预测，对于避免该类人群cARDs的发生以及防止延误基础疾病的治疗都具有重要的意义。
【参考文献】
【1】国家药品不良反应监测中心.http://www.cdr.gov.cn
【2】朱泌媛.别嘌噙醇及β内酰胺类抗生素诱发汉族人群皮肤药物不良反应与人类白细胞抗原基因关联研究.[D]2012-04-16
【3】W e i C Y , L e e M T , C h e n Y T . P h a r m a c o g e n o m i c s o f a d v e r s e d r u g
reactions:implementing personalized medicine[J]. Human Molecular Genetics,2012,21(1):58-65
【4】H L A : a p h a r m a c o g e n o m i c s s u c c e s s s t o r y [ J ] . P h a r m a c o g e n o m i c s,2010,11(3):277-281
【5】HLA:Humanleukocyteantigen.http://en.wikipedia.org/wiki/Human_leukocyte_antigen
【6】Lonjou, C., Borot, N., Sekula, P.,etal. A European study of HLA-B in Stevens-Johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis related to five high-risk drugs[J]. Pharmacogenet. Genomics, 2008,18:99-107.
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【8】Romano, A.,DeSantis, A.,DiFonso, M.,et al. Delayed hypersensitivity to aminopenicillins is related to major histocompatibility complex genes[J].Ann. Allergy Asthma Immunol., 1998,80:433-437.
【9】李成涛.HLA基因分型技术的进展与展望[J].法医学杂志,2004,20(2):120-123
【10】Somkrua, R., Eickman, E. E. et al. Association of HLA-B*5801 allele and allopurinol induced stevensjohnson syndrome and toxic epidermal necrolysis: a systematic review and meta-analysis [J].BMC Medical Genetics, 2011,12:118
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