作者：解放军总医院西院检验科 任军伟 关杰 朱远 白洁 丛玉隆
摘要： 目的 通过江苏英诺华公司新型PL-11血小板分析仪（结果用最大聚集率，maximum aggregation rate , 以PL-MAR%表示）与光比浊法血小板聚集仪（light transmittance aggregometry,LTA），结果用血小板最大聚集率以LTA-MAR%表示）及Verifynow抗血小板治疗监测系统（VerifyNow）结果用血小板抑制百分数INHI% (inhibition of platelet aggregation percentage ）表示，用（100-INHI%）表示Verifynow血小板聚集率进行比较。方法 利用二磷酸腺苷（adenosine phosphate，ADP）诱导的LTA实验，ADP诱导的PL-11血小板分析仪实验，VerifyNow的P2Y12阻断剂检测板实验（VerifyNow）同时检测对照组与单服氯吡格雷患者组（以下用患者组表示）血小板聚集功能。结果 ①对照组与患者组对比，LTA-MAR%，PL-MAR%，INHI% 3个参数有统计学差异（分别为P<0.01和P<0.05）；②PL-MAR%，与（100-INHI%），LTA-MAR%呈正相关（r分别是0.794、0.889）。结论: ①氯吡格雷有抗血小板聚集的药物效果。②PL-11作为一种新型的血小板分析仪，检测结果与LTA法、VerifyNow法结果相关性良好，精密度更高，可作为血小板聚集功能检测的新方法。
关键词：血小板聚集；PL-11；光比浊血小板聚集仪；ADP；VerifyNow；
目前我国心血管疾病患者已超过2.7亿，按全国人口14亿计算，近5个中国人中就有1人患心血管疾病。随着心血管病人抗血小板药物的广泛使用，如何更有效、更准确地掌握个体患者的服药效果，科学地进行个体化治疗，就需要有更好的临床检验监测手段。目前，光比浊法血小板聚集仪（light transmittance aggregometry, LTA）在临床上的使用率超过95%，是临床应用的最多一种检测方法[1]。VerifyNow抗血小板治疗监测系统（VerifyNow）近年来在国际上广泛被研究应用，普遍认为其结果准确、可靠。江苏英诺华公司新推出了一种以电阻抗法连续监测血小板数量判断聚集情况的新型仪器PL-11。本文通过PL-11与LTA及VerifyNow在血小板聚集功能方面的平行检测，达到对PL-11检测性能和方法学的深入了解，使其成为临床医生进行抗血小板药物药效监测及血小板功能检测不可多得的新方法，能够更加准确、有效，快速地服务于患者。
1 材料和方法
1.1 仪器及试剂：CHRONO-LOG MODEL700血小板聚集分析仪及其配套试剂（美国CHRONO-LOG公司）；VerifyNow抗血小板治疗监测系统（上海新仪仪器有限公司引进），及其配套光路质控板，试剂质控物，P2Y12阻断剂检测板，枸橼酸钠真空采血管；PL-11血小板分析仪及配套试剂（南京神州英诺华医疗科技有限公司）；Thermo IEC CL40离心机（美国Thermo公司）；SYSMEX XE-2100血细胞分析仪及其配套试剂（日本Sysmex公司）；枸橼酸钠抗凝管（美国BD公司）。
1.2 观察对象及标本采集：①随机选取17例健康志愿者，男性15例，女性2例；随机选取单服用氯吡格雷（75mg/d）10天以上的心脑血管病患者10例（同时未服用其他抗血小板聚集类药物）。②用4支3.8%枸橼酸钠抗凝真空采血管采集静脉血：3支3ml，1支2ml。2支3ml样本进行LTA实验；1支3ml样本进行英诺华PL-11血小板分析仪实验；1支2ml样本进行VerifyNow P2Y12阻断剂检测板实验。
1.3方法：①光比浊法血小板聚集仪实验[2]（light transmmitance aggregometry）：使用10μmol/L二磷酸腺苷（adenosine diphosphate, ADP）作为诱导剂，用血细胞分析仪测定富血小板血浆（platelet rich plasma, PRP）的血小板浓度，用贫血小板血浆（platelet poor plasma,PPP）调整PRP血小板浓度为（200～300）×109/L[3]，检测ADP诱导血小板聚集率。②VerifyNowP2Y12阻断剂检测板实验：先做光路质控，然后取2ml的Verifynow专用枸橼酸钠抗凝真空采血管标本，于24～28℃稳定10min，上下颠倒混匀10次，倒插入分析仪中，3min后打印结果；③PL-11血小板分析仪实验：将样本置于仪器的待测试位置，按“检测”键，等待测试完毕，打印结果。
1.4主要观察指标： ADP诱导LTA测得血小板最大聚集率（LTA-MAR%）；VerifiNow测得血小板Inhibition of platelet aggregation percentage(INHI%)；PL-11测得最大聚集率（maximum aggregation rate，PL-MAR%。
1.5统计学分析：用EXCEL2007整理数据，用SPSS13.0软件包进行对照组与患者组的配对t检验以及所有观察对象3种测试方法测得参数的双变量相关性分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 对照组与患者组观察指标（参数）对比 LTA测得的LTA-MAR%%；VerifyNow测得的BASE、P2Y12受体的PRU，INHI%；PL-11测得的MAR%。请参见表1。
2.2 所有观察对象PL-MAR%，INHI%，LTA-MAR%3个参数双变量相关性分析 请参见表2。
3 讨论
血小板是血栓形成的重要因素，当血小板活化后，其α、γ及溶酶体等贮存颗粒中的内容物通过开放管道系统（open canalicular system，OCS）发生释放反应，颗粒膜蛋白在质膜上高水平表达，引起CD62p、PAC-1显著性改变[4]。PAC-1与血小板表面的GPⅡb/Ⅲa和血液中的纤维蛋白原（Fg）结合[5]，在Ca2+的协助下发生血小板聚集[6]。因此，检测血小板聚集功能对于早期血栓形成的风险评估，阐明相关疾病的病理机制及临床选择正确的治疗方案等有重要意义。
光学比浊血小板聚集功能检测是将PRP置于比色杯中，加入诱导剂后，用涂硅小磁粒进行搅拌，血小板逐渐聚集。光探测器接收这一血小板聚集反应体系中连续变化的光信号，经过转换，最终将透射光的强度变化通过光强度-时间变化曲线描绘出来，就可直接通过图表观察到血小板聚集的全过程，以此反映出血小板聚集的速度、程度、血小板解聚等方面的参数和信息[7]。VerifyNow通过血小板上与ADP结合的P2Y12和P2Y1两种受体的不同，加入前列腺素E1（PGE1）抑制ADP与P2Y1受体结合，使仪器特异性检测病人服用噻氯吡啶类（thienopyridines）药物（如氯吡格雷等）后的血小板聚集功能。同时，采用凝血酶受体激活途径（Thrombin receptor Activators）激活血小板聚集，以检测病人血小板聚集功能的基线(不受P2Y12阻断剂影响的通路)，两者对比之后得出药物抑制血小板聚集率—INHI%。PL-11血小板分析仪是通过在抗凝全血中加入诱聚剂使血小板发生聚集，仪器均匀选取若干测试点测定非聚全血中的血小板数量，通过与ADP诱聚前最开始测得的两次血小板数量平均值对比得出血小板聚集率，以此反映血小板聚集功能，所测参数有血小板最大聚集率（MAR%）、血小板最大聚集点（MAP%）、血小板平均聚集率（AAR%）、血小板数量、平均血小板体积（MPV）、红细胞数量、平均红细胞体积（MCV）7个参数。
本实验中，首先，从表1结果可以看出健康对照组与患者组相比，LTA-MAR%、PL-MAR%、INHI% 3个参数在2组之间都有显著性差异。这说明：①氯吡格雷具有一定的抗血小板聚集功能，只是药效不强，原因可能与其他一些因素有关，如遗传变异性、患者依从性差、氯吡格雷剂量不足以及CYP3A4相关的药物间相互作用等[8]；②PL-11作为江苏英诺华医疗技术有限公司新近上市的新型血小板分析仪，其准确测得对照组与患者组的结果差异，证明其完全可以满足临床的检测需求。再者，PL-11测得患者PL-MAR%结果是53.7±6.3，与对照组MAR%结果70.1±9.0相比，约减低24%，同时LTA测得的LTA-MAR%约减低38%，VerifyNow测得的（100-INHI%）约减低19%，PL-11的结果变化率正介于二者中间，说明PL-11方法兼具了LTA法和VerifyNow法的优点，或者说PL-11方法克服了LTA法和VerifyNow法的缺点，结果更加符合真实情况。分析原因：①LTA使用的是离心血浆，它的检测状态与体内全血的凝集状态有较大差异，主要是它去除了红细胞参与聚集所产生的效果，而红细胞对于体内血栓的形成是十分重要的；②VerifyNow虽然也是使用全血测定，但是它以凝血酶作为聚集基线（plateletaggregation baseline, BASE），这本身就不十分科学，因为众所周知，血小板有许多聚集通路，凝血酶通路并不代表真正的血小板最大聚集能力，我们在实验中经常发现P2Y12受体的Reaction Units值（PRU）大于BASE的情况出现，而此时仪器给出的Inhibitionof platelet aggregation percentage 即INHI%直接为“0”，事实上INHI%是否真正为“0”，我们不得而知，唯一的办法就是通过其他的检测方法重新检验。这种情况的发生恰好证明了凝血酶通路并不代表真正血小板最大聚集能力这个论断。
从表2的结果可以看出PL-11测得的PL-MAR%与VerifyNow测得的(100-INHI%)相关性良好（r=0.794），与LTA测得的LTA-MAR%相关性非常好（r=0.889）。而目前许多人仍认为LTA是血小板聚集功能检测的金标准[1]。VerifyNow新近在国际上也逐渐被大家所认可。
参考文献
1 Michelson AD. Plateletfunction testing in cardiovascular diseases[J]. Circulation . 2004; 110:e489–e493.
2 吴涛,刘景汉,李卉,等. 亚硝基谷胱甘肽对冰冻血小板聚集及一氧化氮. 中国实验血液学杂志,2012,20:386-389.
3 谭大伟,朱平,李小鹰. 氯吡格雷抑制血小板功能的两种检测方法比较: 血小板聚集实验与血小板膜糖蛋白检测. 中国组织工程研究与临床康复,2007,11:2021-2024.
4 徐培敬,陈颖,胡友东. 急性脑梗死硫酸氢氯吡格雷治疗前后CD62P和CD63的关系[j]. 中国误诊学杂志, 2012, 12 (8):1834:1835.
5 张炘, 段传志, 李铁林, 等.血小板活化特异性标志物PAC-1和CD62p与急性脑梗死病情严重程度的相关性[J].中国神经精神疾病杂志, 2011, 37(11):698-671.
6 丛玉隆, 王丁等. 当代检验分析技术与临床[M]. 中国科学技术出版社. 2002: 106-115
7 邹雄, 丛玉隆, 陈瑜, 等. 临床检验仪器. 北京:中国医药科技出版社, 2010, 110-116.
