英国剑桥大学血液系输血医学部的Jean-Pierre Allain教授最近在中国和东亚进行了巡回学术演讲。他在演讲中强调，对单人份血样进行核酸检测（ID-NAT），可以进一步保证临床输血和输注血浆制品的安全性。
演讲重点：
- 核酸检测能对血液中HIV、HCV、HBV病毒的检出提供最大的检测灵敏度
- 单人份核酸检测可以保证对低病毒载量的血样的检出
- 如果人群中抗-HBc阳性率超过10%，则对其进行筛查将不符合成本效益
- 血库在保证血液供应的同时，必须最大程度确保血液安全
- 单人份核酸检测联合血清学HBsAg、抗-HIV和抗-HCV检测是目前确保血液安全的必要检测策略
- 针对A2基因型的乙型肝炎病毒重组疫苗，并不一定能对中国和其它亚洲地区普遍存在的B和C基因型乙型肝炎病毒有很好的预防效果，尤其在抗-HBs抗体的滴度低时更是如此
背景
人类免疫缺陷病毒（HIV），丙型肝炎病毒（HCV）和乙型肝炎病毒（HBV）的感染早期动力学和感染窗口期（WP）有很大差异，这对经输血或输用血浆制品导致的病毒传播风险有很大的影响。
现有的血清学检验方法，在病毒感染后检测出HIV抗体（抗-HIV），HCV抗体（抗-HCV）和乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的时间方面大有不同。能检测出抗-HIV、抗-HCV和HBsAg阳性的时间大约分别在感染后20天、65天和36至55天。
HIV和HCV
图1显示在血清转阳之前HIV和HCV标志物的演化情况。在隐蔽期（eclipse phase），血液中检测不出病毒标志物，此时血液尚不具传染性。而所谓“窗口期”，则是指从感染病毒开始到可以用血清学或核酸检测（NAT）方法检出病毒的这一段时间。
已有许多研究对核酸检测在影响HIV和HCV病毒传播风险方面进行了探讨，其中有两项研究在美国和法国进行，采用核酸检测联合血清学检测对16人份至24人份血清样本进行了检测。结果显示，与单用血清学检测相比，联合核酸检测可降低输血后HCV感染残余风险达6倍；降低HIV感染残余风险30%。检测效果的不同是因这两种病毒感染窗口期的长短有所不同所导致。
南非的一项研究对HIV核酸检测的效果进行了分析，发现对重复献血者的血样进行HIV小样本混样核酸检测（MP-NAT），可以检出略多的HIV窗口期感染患者，但会漏检所谓的“非凡控制者”（elite con-trollers）。非凡控制者的血液抗-HIV呈阳性，但却检测不到HIV RNA。相比之下，单人份核酸检测（IDNAT）比小样本混样核酸检测有更高的灵敏度，可以检测出更多的窗口期感染，同时减少对HIV非凡控制者的漏检。
南非的研究人员进一步研究了MP-NAT和ID-NAT对检测结果的影响，他们把42个窗口期HIV RNA阳性样本从1:2稀释到1:16。结果发现，当样本被稀释时，HIV的检出率明显降低。例如：当稀释到1:8时，24%原来HIV RNA阳性的血样会被漏检。
美国红十字会的一项研究进一步证实了核酸检测的重要性。研究人员对35名HCV核酸检测阳性的献血者进行了随访检测，35人的HCV RNA检测呈阳性，其中33人血清转阳，检测到抗-HCV。其余2例没有出现血清转阳的病人是慢性HCV感染者，其机体无法对病毒感染作出免疫反应，所以没有产生HCV抗体（即抗-HCV呈阴性）。
虽然现在有多种检测HIV和HCV病毒抗原的方法，但相比核酸检测，这些方法不具有任何优势。HCV病毒抗原的窗口期覆盖率约为90%，HIV p24抗原的窗口期覆盖率仅为50%。
此外，成本效益、血液感染的额外风险、检测方法的可获得性等问题，都是在决定采用单人份核酸检测或小样本混样核酸检测时必须考虑的，并且还牵涉到感染残余风险、血液安全的影响以及能否及时提供血液库存等诸多问题。
“就HIV检测效果而言，单人份核算检测比混样核酸检测有更高的灵敏度……”
HBV
乙型肝炎病毒感染在中国是一个非常严重的问题，其发生率相当高，每10名献血者中约有1人是慢性感染者。此外，在检测HBV主要标志物HBsAg和HBV DNA时，这些HBV阳性献血者中，两项检测指标都呈阳性者占85%；只检测出HBsAg阳性者占6%；只检测出HBV DNA阳性者占9%，这些献血者都具有传染性。
大多数免疫机制健全的患者在HBV感染恢复期会先产生乙型肝炎核心抗原的抗体（抗-HBc），然后产生乙型肝炎表面抗原的抗体（抗-HBs）。随着时间的推移，抗-HBs的浓度逐渐降低，有时会降低至完全检测不出，而只能检测出抗-HBc。有一些患者，无论其血液同时有抗-HBs和抗-HBc，或只有抗-HBc，只要检测出HBV DNA，都属于隐匿性乙型肝炎病毒感染（OBI）。
不过，当免疫机制不全或免疫缺陷者有慢性HBV感染时，在感染后的很长一段时期内都可以同时检测出HBsAg和HBV DNA，并会产生抗-HBc，但不产生抗-HBs。随着时间的推移，HBsAg会有可能检测不出，但HBV DNA和抗-HBc依然可被检出，这是第二种类型的隐匿性乙型肝炎病毒感染。
成人在感染乙型肝炎病毒的早期，在隐蔽期是检测不出任何病毒标志物的；在感染后15至20天，可以检测出HBV DNA，而且其浓度每2.6天倍增一次；大约再过15天以后，可以检测出HBsAg，并且HBV DNA和HBsAg的浓度同时达到高峰。之后，HBVDNA和HBsAg的浓度同时下降，但由于抗-HBs的出现，HBsAg浓度的下降变得更迅速。因此，在感染后的75至85天时，会出现第二个窗口期。此时检测不出HBsAg，抗-HBs也尚未能被检出，但可以检测出HBV DNA。
乙型肝炎病毒基因型和地域差异
在亚洲， 根据台北、香港、吉隆坡和曼谷的血液中心数据显示， 来自泰国的样品中HBsAg 的浓度明显高于台湾（P<0.0001）,且80%泰国献血者的HBV基因型为C型；但在台湾，90%献血者的HBV基因型为B型。当比较B和C基因的HBsAg浓度时发现，C基因型的HBsAg浓度显著高于B基因型，这便可以解释台湾和泰国所观察到的现象。
在不同HBV基因型人群中，病毒载量也有显著差别。就无症状的HBsAg阳性献血者而言，在HBV基因型为B型和C型的献血者中，病毒载量>10^5IU/mL者占40%，而在HBV基因型为A2，D和E型献血者中则占<20%。这可以解释为什么在亚洲，乙型肝炎病毒的垂直传播比较常见，而在非洲则比较少见。同样，在HBV基因型为B型和C型的HBsAg阳性血样中，HBV DNA的漏检情况很少见。但在HBV基因型为D型和E型血样中，HBV DNA的漏检情况约占10%。南非的HBV流行情况也较普遍，有一项研究对当地290万名献血者的血样进行了核酸检测分析。结果发现，在HBV阳性血样中，有85.6%的样本同时检测出HBsAg和HBV DNA，11.5%的样本只检测出HBV DNA，2.9%只检测出HBsAg 。在只检测出HBV DNA的样本中，三分之一为窗口期感染，三分之二为隐匿性乙型肝炎病毒感染。
根据东南亚五个血液中心的研究数据发现，HBV DNA的检出（yield，定义为HBV DNA阳性，HBsAg阴性）的比例在各个国家有很大差异。例如：台湾为1:980，新加坡为1:18060，差异取决于疾病在当地的流行情况和重复献血者的比例。在这些HBV DNA阳性样本中，79%的患者是隐匿性乙型肝炎病毒感染，13%是窗口期感染。
“就HBV检测效果而言，单人份核酸检测能比混样核酸检测检出更多的传染性乙型肝炎窗口期感染和隐匿性乙型肝炎病毒感染病例”
此外，东南亚和中国的数据显示，这些地区的隐匿性乙型肝炎病毒感染率是1:4000，数据是按血样HBV DNA被定量为持续<100 IU/mL来作判断和结果预测的。如果在筛检时不采用单人份核酸检测而采用6人份或者10人份核酸检测，并且灵敏度的分析值设为5IU/mL，那么结果就会有分别多达70.7%和87.5%的阳性样本会被漏检（图2）。因此，在筛检献血者的HBV DNA时，检测的灵敏度至关重要。
乙型肝炎病毒检测的分析步骤和抗-HBc的局限性
图3为HBV DNA阳性血样的进一步分析检测的流程及随访步骤示意图。首先对HBsAg阴性，但HBV DNA检测呈阳性的样品进行抗-HBc检测。如果其抗-HBc结果为阳性，那么进一步用抗-HBs检测可将其分类为抗-HBs阳性隐匿性乙型肝炎病毒感染（占40%）或抗-HBs阴性隐匿性乙型肝炎病毒感染（占40%）。如果抗-HBc检测为阴性，抗-HBs检测也为阴性，血样可归类为窗口期感染（占10%）；如果抗-HBc检测为阴性，而抗-HBs检测为阳性，血样则可归类为抗-HBs阳性隐匿性乙型肝炎病毒感染（占10%）。
有关血清学和核酸检测在HBV、HIV和HCV检测中的应用，就目前的检测灵敏度而言，血清学检测方法可以检测到核酸检测不能检测到的样品。不过，这些血样仍可以导致HBV和HIV病毒的传播，而核酸检测不仅可以检测出这三种病毒的窗口期感染，还能检测出隐匿性乙型肝炎病毒感染。
就HBV筛检方法的测检效果而言，单人份核酸检测能比混样核酸检测检出更多的传染性乙型肝炎病毒窗口期感染和隐匿性乙型肝炎病毒感染病例。
此外，如果将抗-HBc作为HBV感染的血清学标志物，它只能用于检测隐匿性乙型肝炎病毒感染病例。不过，如果人群中抗-HBc阳性率超过10%，对其进行筛检并不符合成本效益，这是因为血样弃用和补充这些弃用的血样以维持血液供应的累计成本十分高昂。
病毒感染、HBV疫苗的效果和影响
当血液HBV DNA浓度高，又没有出现中和性抗体的情况下，窗口期的病毒传染性最大，随着中和性抗体浓度的增高，病毒的传染性随之下降。
有研究分别对窗口期感染、只有抗-HBc阳性的隐匿性乙型肝炎病毒感染、以及抗-HBs阳性的隐匿性乙型肝炎病毒感染进行传染性比较，结果发现，窗口期感染的传染性最大，只是不同的病毒载量具有不同的传染性。当病毒载量>100 IU/mL时，传染性为63%；当病毒量<100 IU/mL时，传染性为43%13。在只有抗-HBc阳性的隐匿性乙型肝炎病毒感染患者中，10%至17%具传染性，而当抗-HBs呈阳性时，传染性仅为1.3%。虽然此研究的样本比较少，但已经可以说明问题。
为了检验HBsAg联合抗-HBc检测能否保证血液达到HBV安全的效果，一项研究对美国红十字会的370万名献血者进行了HBV核酸检测筛检。正如风险模式的预期一样，1:712000的献血者有窗口期感染，并且都是感染A2基因型病毒。
“六名曾经接种过HBV疫苗的献血者被意外发现HBV DNA检测呈阳性反应”
然而有意思的是，6名曾经接种过HBV疫苗的献血者被意外发现HBV DNA呈阳性反应，但病毒为其他基因型，而非美国最常见的A2基因型。这6人当中，有5人的抗-HBs呈阳性。此外，对这6人的性伴侣进行的追踪检测发现，其中4名性伴侣有慢性HBV感染，并且病毒载量较高（>2×10^6IU/mL）。病毒的基因型和基因序列与鲜血者的病毒完全一致，证实是这些性伴侣将病毒传染给献血者。
就曾接种HBV疫苗但受过感染的献血者样品中的HBV病毒标志物演化过程而言，HBV DNA分别在140和80天时达到峰值，有一部分还可同时检测出HBsAg，之后才出现抗-HBc和抗-HBs的免疫反应。
这一演化过程表明机体出现了急性感染，但与通常的急性感染相比，HBV NDA和HBsAg标志物的出现被延迟了20至50天。此外，患者没有肝炎的临床症状，转氨酶也没有升高。虽然急性感染被阻止，但疫苗抗体不能防止非A2基因型病毒的感染。因此，将这些受感染但接种过疫苗献血者的血液用于临床使用是不安全的。
这些数据有非常重要的意义，尤其是对东亚国家，因为在这些国家中，接种A2基因型HBV疫苗后，由疫苗诱导所产生的病毒抗体对其它基因型的病毒并不安全有效。再者，上述研究发现的所有感染者的抗-HBs滴度都<100 IU/L，说明在<100 IU/L时，疫苗诱导的抗-HBs看来只能预防A2基因型病毒的感染，对其它基因型无效。在亚洲，由于非A2基因型病毒较为流行，因此需要通过多次注射疫苗加强剂将抗-HBs的滴度维持在至少100 IU/L或更高来达到完全免疫预防的目的。此外，除非有科学证据反对，否则所有疫苗接种者，如果受到乙型肝炎病毒感染，则其血液也都是不安全的。
问 与 答
问：如果我们采用HIV/HCV核酸检测，是否还需要再进行HIV或HCV的抗原抗体酶联检测呢？
Allain教授答：HIV/HCV核酸检测和HIV或者HCV抗原检测完全重叠，尤其是应用于单人份样本时更是如此。HIV/HCV核酸检测可检出几乎所有窗口期感染样本，而目前还没有证据表明隐蔽期也可能有传染性。
问：在常规核酸检测筛检时，HIV-2的检测重要吗？
Allain教授答：与HIV-1相比，HIV-2的致病性较弱，并且该病毒的流行主要局限于西非地区。当然，偶尔也会有可能在西非以外的地区出现这种病毒，例如在法国和英国这些接受大批西非移民的国家。据我所知，目前在东亚地区还没有发现HIV-2感染病例。除了HIV-2非常少见以外，目前血清学抗-HIV的检测方法中已经包含了对HIV-2抗体的检测，因此HIV-2核酸检测的应用就只局限于检测窗口期感染。如果在中国所有的HIV感染中，HIV-2感染风险为1:500000，而5年感染的窗口期为15天，那么HIV-2感染的残余风险为500000×122或1:6100万，这几乎可以忽略不计。
问：我们应重视HBV血清学检测，尤其是抗-HBc检测，还是应重视核酸检测？另外，如果进行了核酸检测，是否可以不再进行抗-HBc检测？
Allain教授答：目前只有少数国家采用抗-HBc筛检来提高血液HBV的安全性，这些国家的抗-HBc发生率均<2%，例如美国、加拿大和德国。在抗-HBc发生率较高的地区，如果采用抗-HBc筛检，效用就太低，一方面成本效益差，另一方面对供血的影响很大。根据英国（抗-HBc为0.4%）、荷兰（抗-HBc为1%）和地中海国家（抗-HBc为4-8%）的发生率情况，这些国家均采用HBV核酸检测。但在发生率较高的国家，例如中国和其它亚洲国家，抗-HBc发生率高达20%至60%，这对血液供应几乎有摧毁性影响。即使只对抗-HBs阳性血样进行抗-HBc检测，并在临床上使用抗-HBs阳性血样，也很难减轻抗-HBc对供血的影响。而在抗-HBc阳性样本中，检出可能具有传染性的HBV DNA阳性样本不会超过2%。所以，一篇尚未发表的成本效益研究报告表明：如果抗-HBc发生率超过10%，采用核酸检测比采用抗-HBc检测更为经济。这是因为被弃用的血液样本的成本非常高（每单位超过50美元）。此外，为了维持血液供应，还要考虑补充被弃用血样而必须增加的采血费用。
问：在核酸检测中，如何避免乙型肝炎病毒的突变问题呢？
Allain教授答：乙型肝炎病毒在病毒复制过程中是没有校对的，所以突变的机会比较高。不过，病毒基因组的某些区域还是高度保守的，因此，如果在核酸检测中使用的引物和探针是针对这些区域的话，那么所有的突变都能够被检测出来。目前，没有证据显示市场上所用的核酸检测会漏检任何乙型肝炎病毒的突变。相反，HBsAg检测则可能会漏检S蛋白的主要亲水区域的变异体，而这种S蛋白在检测中是用于捕获HBsAg的。HBsAg检测的这种漏检情况，在隐匿性乙型肝炎病毒感染中特别多见。最近在《肝脏病学》杂志上有一篇文章专门谈到了这个问题。该文章的详情为：El Chaar M, et al. lmpact of Hepatitis B virus surface protein mutations on the diagnosis of occult Hepatitis B virus infection.Hepatology 2010; 52:1600-10.
问：就美国红十字会的数据，采用接种过HBV疫苗献血者的血液输血是否有危险？
Allain教授答：与没有接种过HBV疫苗者相比，采用接种过HBV疫苗献血者的血液输血，传播HBV的风险大幅度降低。在中国的献血者中，HBsAg阳性的慢性感染者约占8%，其中约5%的核酸检测呈阴性。相反，献血者中隐匿性乙型肝炎病毒感染（即核酸检测阳性/HBsAg阴性）者约占6%至9%。除非同时进行HBsAg和核酸检测，否则采用这些慢性感染者的血液输血，传播HBV的风险就会很大。
在美国的献血者中，接种过HBV疫苗者占45%，如果用核酸检测对370万献血者或对1665000名接种过疫苗的献血者进行筛检，会检出6名HBV DNA阳性者，比例为1:277500。另外，在这些献血者中，抗-HBs的出现也会显著降低其血液的传染性。所以，接种过疫苗的献血者传播乙型肝炎的危险性非常低，应当鼓励献血者接种HBV疫苗。
