众所周知，每个人的外周血中和一些体液中均有游离DNA的存在，其主要来自于机体细胞的凋亡。最早是在1947年代由法国学者Mandel和Metais发现并发表在法文杂志上，其后近20余年一直未受人关注，直到1966年，美国洛克菲勒大学的Kunkel等发现在部分系统性红斑狼疮患者的血清中存在游离DNA，并且证明其可与患者血清中抗-DNA抗体反应，形成免疫复合物，与疾病的发生发展有关。随后70-80年代，瑞士日内瓦大学的Anker与Stroun等发现在肿瘤患者的外周血中存在游离DNA，并明确了血浆游离DNA为双链，大小范围分布0.5kb-21Kb。1997年Lo等报道在怀有男胎的孕妇外周血中检测到了Y染色体存在，证明孕妇外周血中存在胎儿的游离DNA（cell-free fetal DNA，cff DNA）。为通过分析从母体血液中获得的这种来源的胚胎遗传物质，发展了基于基因组学的无创产前检测（Genomics-based noninvasive prenatal testing，gNIPT）技术提供了基础。
一、母体外周血中胎儿游离DNA的来源、特性及变化
胎盘、胎儿造血干细胞和胎儿本身都被认为是母体循环中胎儿DNA的可能来源。胚胎细胞在穿过胎盘时破裂，游离DNA即会进入母体血液循环中，研究表明，43％-50％的胎儿有核红细胞会凋亡。但母体血液中大部分胎儿游离DNA来自于胎盘，怀孕28天后cff DNA的最可能来源是滋养层，而不是胎儿造血干细胞，因为直到怀孕28-30后胎盘循环才建立。胎盘大小不会影响母体血浆cff DNA水平，cff DNA在母体血浆浓度升高可能反映胎盘缺氧和滋养细胞的凋亡或坏死。母体血浆中cffDNA含量占总游离DNA的大约5-10％，长约150bp，怀孕4周即能检出，其在血液中的半衰期只有16min，出现2小时后即不能测出。CFF核酸在母体循环中较稳定，可能与来源于胎盘的微粒能够保护他们免受核酸酶降解相关。Cff DNA随着妊娠孕龄增加而增多，在前三个月每周增加21％，在孕中期上升速度较慢，在孕期的后八个星期又急剧上升。分娩后Cff DNA又迅速地以半衰期为16min的速度从母体循环中被清除。为了以这样短的半衰期保持稳定的状态，胎儿DNA必须连续大量地释放到母体循环。cff DNA在-20℃下可稳定超过4年，但血浆样本在-20℃下长时间保存，cff DNA每月以-0.66GE/ml速率降解。
二、母体外周血中胎儿游离mRNA的来源、特性及变化
由上所述，母体血循环存cffDNA，Y染色体有关的cff DNA与胎儿性别有关，Poon等怀有男性胎儿的母体外周血测到了由Y染色体转录而来的mRNA，说明孕妇血液循环中除了存在胎儿游离DNA外，还来自胎儿的游离mRNA（cell-free fetal mRN，cff mRNA）。与cff DNA一样，由于受到来自胎盘微粒的保护，cff mRNA在外周血中同样非常稳定，同样，胎盘也是cff mRNA的主要来源，胎儿造血干细胞也可能释放cff mRNA。孕后4周，母体血浆中即检测到cff mRNA，在母体血液中的半衰期为14min，如同cff DNA一样，分娩后，cff mRNA也能迅速从母体血液中清除。与cff DNA不同的是，总cff mRNA水平在整个妊娠期保持衡定，对cff DNA水平有影响的侵入性操作并不影响mRNA水平。
三、孕妇外周血cff DNA检测的临床应用
（一）与特定疾病产前诊断有关的胎儿性别无创鉴定
胎儿性别鉴定，是诸如X连锁疾病等的产前诊断决策依据。采用PCR方法扩增检测孕妇外周血cff DNA中的性别决定基因（SRY）能准确的鉴定胎儿性别，测定准确度与胎龄有关，胎龄越大，准确度越高。研究表明，妊娠7周胎儿性别鉴定准确率为80％，妊娠9周的准确率高达100％。一项利用Y染色体的剔除了无精症区域的长臂的研究证明，在妊娠5周就能检测胎儿性别，妊娠8周准确率达100%。实时荧光PCR因其灵敏度高且不易受污染，在采用cff DNA鉴定胎儿性别中，检测的特异性和敏感性要优于普通PCR方法。检测所用的标本可以新鲜分离的孕妇血浆，也可采用孕妇干血斑。
（二）无创胎儿RhD基因分型
RhD阴性孕妇怀有RhD阳性胎儿时，易引起胎-母血型不合，常致胎儿死亡或新生儿黄疸，因此，对新生儿RhD血型进行出生前检测明确，对RhD阴性孕妇的孕期监测和新生儿溶血病的预防和治疗非常关键。Lo等首先采用母血cff DNA无创检测胎儿的RhD基因型，结果表明孕中期和孕晚期cff DNA胎儿的RhD基因型检测，可得到更可靠的诊断；孕早期则仅有78％的符合率。而采用实时荧光PCR技术使随后孕早期RhD测定的灵敏度增加到了100％，但有假阳性结果，尤其是RhD阴性的非洲黑人最容易出现假阳性结果，他们的RHD型是完整的，但不起作用，称为RhDψ，或混合RHD-CE-DS基因，可采用特殊设计的序列特异性引物RT-PCR扩增来区分RhDψ和RhD。
（三）单基因遗传病的无创产前检测
已知的单基因遗传病有3,000多种，在国内较为多见的地中海贫血、血友病、NMD等均属于此类。Cff DNA也可这些单基因遗传病的产前诊断提供了可能，检测cff DNA中基因突变可采用突变特异性的实时荧光PCR方法，但遗传病通常有较多的突变，如β地中海贫血报道的点突变有200多种，采用基于特异引物或探针的实时荧光PCR来检测则缺乏，目前国内较多应用的商品试剂盒均为PCR-膜上斑点杂交的方法。国内外也有采用PCR-基质辅助激光解吸离子/飞行时间（matrix-assisted laser desorption ionization/timeof-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）方法、数字PCR、肽核酸、高分辨熔点曲线分析、高通量测序方法的报道。高通量测序技术由于其检测灵敏度高，无需特异的引物或探针设计，展示了广阔的应用前景。此外，在采用cff DNA检测单基因疾病时，由于cff DNA片段要小于母体本身的游离DNA片段，可采用凝胶电泳方法富集片段较小的部分，用于后续的扩增检测，可提高检测的灵敏度。
（四）胎儿染色体非整倍体的无创产前筛查
高危孕妇外周血cff DNA也可作为胎儿染色体非整倍体无创产前筛查的有效标本，所采用的检测技术包括最常用的定量PCR、质谱、数字PCR和新一代高通量大规模平行DNA测序等，同样可根据母体本身游离DNA与cff DNA的片段大小不同来增加胚胎DNA的相对量，包括选择最短的DNA的片段以及鉴定通常的胚胎标志如DNA甲基化模式。方法的基本原理是通过使用各种分子检测方法鉴定数百万条小cff DNA片段的染色体起源，并进行计数，以及定量计数目标染色体（例如21号染色体）序列，并与正常妊娠预计的数量进行比较，如果胚胎为21三体型，与正常妊娠比较，母体血浆所有cff DNA中源于21号染色体的DNA会有一个小的相对增加，从而指示胚胎为21三体型。
从近期已发表的前瞻性研究文献看，gNIPT在高危孕妇中，对21三体型的检出率>99%，假阳性率<0.5%，阳性预示值为97.94%。但不能报告结果的比率在1%-5%。有关gNIPT用于胎儿染色体非整倍体检测，美国遗传学国家卫生职业教育联盟（the National Coalition for Health Professional Education in Genetics)、美国国家遗传顾问协会（the National Society of Genetic Counselors）、国际产前诊断协会（the International Society for Prenatal Diagnosis）、加拿大妇产科协会（the Society of Obstetricians and Gynecologists of Canada）和加利福尼亚技术评估论坛（the California Technology Assessment Forum）等建议高危孕妇在经有资质人员的非指导性咨询后，可选择gNIPT检测胎儿染色体非整倍体。
此外，研究表明母体血液中cff DNA的变化可作为反映胎盘异常的指标。Cff DNA水平升高可见于前置胎盘、宫缩乏力，分泌障碍和先兆子痫等。当胎儿出现宫内生长受限时，母体血浆cff DNA水平则出现下降。
四、孕妇外周血cff mRNA检测的临床应用
相对于cff DNA，cff mRNA检测的临床应用研究很少，一些初步的研究表明，通过对母体血中mRNA分析，确定了71个与胎儿发育有关的mRNA，包括27个发育基因（48％包含神经发育的基因），5个感官知觉基因（听觉，视觉，嗅觉），22个参与胎儿生理功能基因和17个免疫防御基因等，可用于追踪胎儿发育。
此外，cff mRNA也可用于21三体型的无创诊断，可通过检测母体血浆中21号染色体特异mRNA等位基因比值检测21三体型，但只有90％的诊断敏感度和96.5％的特异性。
