HiSeq X 10在Cluster生长中，很可能是用Recombinase Polymerase Amplification(RPA)技术让有效的单克隆cluster的比例达到了60%以上。而不再采用与HiSeq 2000一样基于碱变性的桥式PCR来长cluster。
这样做的原因是：碱式PCR与热PCR的原理同，每一个循环只能扩增一轮。会受到泊松分布（Poisson distribution）的限制，有效的单克隆cluster最多只能达到总孔数的1/3，还有约1/3是空well，再有1/3是多克隆(polyclonal)。而只有单克隆的well/cluster才是有用的，那些空well和多克隆都是无用的well/cluster。
在Ion Torrent和Roche 454的油包水PCR中，有效的单克隆珠子数最多只占总珠子数的33%，就是因为受到泊松分布的限制。
RPA技术之所以可以让有效单克隆孔达到60%以上，是因为：RPA的启动较慢，也就是RecA蛋白-扩增引物复合物与模板链的结合是较慢的过程。但是一旦启动复制就快速倍增，并且很快耗尽一个well中所有的primer，让后来的模板DNA分子不能再与第一个模板DNA分子竞争。形成一个模板对一个well的独占。由此绕过了泊松分布的限制。
RPA技术不仅让单克隆率提高到60%以上，还让测序上样量的容忍度提到到20%。因为RPA可以让模板链找well的过程变成：先到先占座，后到的就没有座位。先扩增的模板对后到的模板形成抑制，由此减少了对上样量的依赖。
而在之前的HiSeq 2000上，最终的数据产量和质量是对上样量很敏度的。上样少了，cluster数太少，总数据量太少；上样多了，cluster太密，相互overlap，PF值就较低，Q30比例也会下降。
RPA扩增的原理：
用重组蛋白A（图中黄色颗粒）与扩增引物（蓝色、红色曲线）相结合，所形成的复合物可以插入到双链模板中有与引物相同序列的位置，形成一个合成启始位点
SSB蛋白（Single strand DNA binding protein，图中绿色颗粒）与被解链的的双链中那条剩下的单链相结合。这一方面稳定了单链，同时也是让扩增引物与模板结合得更牢固，也就是说减少单链对模板的结合竞争力
聚合酶结合到扩增引物与模板的复合物上，开始合成新链
上述过程周而复始，完成对目标模板的扩增
RPA技术的专利号是“US7270981 B2”。由Niall A. Armes, Derek L. Stemple发明，2003-02-21申请专利。
参考资料：
http://www.google.com/patents/US7270981
http://159.226.100.150:8082/biotech/CN/abstract/abstract15416.shtml#
编辑：范伟伟
