分子诊断直接以疾病相关基因及其产物为检测对象，从分子水平探讨疾病发生和发展的机制，从而为疾病预防与诊断、疗效评估、预后判断等提供关键信息和决策依据。20世纪70年代，Kan等首次应用DNA分子杂交技术成功诊断镰形细胞贫血症，这标志着临床检验开始进入分子诊断时代。随着技术的不断发展，特别是20世纪80年代中期PCR的建立，分子诊断的应用范畴不断扩大，不仅在感染性疾病中得到了广泛应用，而且在其他疾病，特别是遗传性疾病及肿瘤领域得到有效推广。由于很多传统临床诊断方法的特异度和敏感度较差，它们正在逐步被发展迅速的分子诊断方法所取代，粗略统计目前已有2200多项分子诊断项目应用于临床。随着传统医疗模式的转变，社会对分子诊断的需求不断增加，分子诊断市场份额快速扩张，预计未来将以11％的年增长率快速递增，到2015年全球产值可达80.85亿美元。
然而随着分子诊断行业快速扩张，分子诊断的质量问题也随之凸显。虽然能力验证／室间质评(proficiency testing／external quality assessment，PI／EQA)信息表明分子诊断实验室间的结果一致性较好，但是最近有关EB病毒(epstein．barr virus，EBV)和人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)检测的能力验证报告指出分子诊断缺乏重复性与可比性，究其原因主要是当前缺乏可用的国际标准物质。即使在分子诊断应用广泛的传染性疾病领域，目前WHO也仅有几种国际标准物质可供使用，这说明相关国际标准物质的研发远远滞后于分子诊断工艺的发展。标准物质的匮乏可对分子诊断质量产生多方面影响，它会导致试剂生产商无法保证其试剂定量检测结果的溯源性，从而使得使用不同试剂或相同试剂不同批号的临床实验室间结果不具可比性；它也会导致临床实验室不能对检测方法和工作程序的有效性进行评价，从而不能保证检验结果的准确可靠。国际相关机构已认识到此问题的重要性与复杂性，正在加大力度开发所需的国际标准物质用于临床分子诊断，同时为了加强分子诊断标准物质研制与应用的标准化，目前也已制定了多个适用于分子诊断标准物质的指南文件：如WHO的《国际和其他生物标准品制备、特性和建立的有关建议》、ILAC—G9：2005：《标准物质的选择和使用指南》、CLSI—C53：《检验医学中互通性标准物质的特性和要求；核准指南》等，这些指南文件的出台使得标准物质开发与应用更为规范，进而更为有效地保证了临床分子诊断结果的准确性，这也是不同临床实验室间检测结果走向有条件互认的前提。
一、感染性疾病相关的分子诊断国际标准物质
核酸检测对于病原微生物的早期诊断和疗效观察具有重要价值，目前多应用核酸扩增技术检测病原体相关基因，最常用的是实时荧光定量PCR(real．time PCR)方法。为确保检测结果的准确与可靠，临床实验室必须引入良好的质量控制体系，如必须使用质控品进行严格的质量控制，而对于定量测定项目，通常还需使用可溯源至相应国际标准物质的标准品。国际标准物质是临床分子诊断的核心，它可使临床实验室间的检测数据具有可比性。当前使用最为广泛的国际标准物质由WHO提供，最初主要用于疫苗制备与血液制品分析中，近些年逐步在分子诊断领域中得到大力推广，主要用于血源性病毒的定量分子诊断分析，如HBV、HCV和HIV等。
WHO一直致力于国际标准物质的开发与制备，它的第一个分子诊断标准物质是1997年获得认可的HCV国际标准物质，它是将含高滴度HCV．1a病毒的血浆稀释后冻干制得。WHO的合作中心实验室英国国家生物标准与检定所(National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC)负责组织22家实验室对其及另外2种候选物质进行测定，分别采用不同的商业或实验室开发的方法(主要是传统PCR方法)，并对检测数据进行分析汇总，从而确定第一代WHO HCV国际标准物质(96／790)定值为100 000 IU／ml。
随后HCV国际标准物质历经版本更迭，先后被第二代(2003年)和第三代国际标准物质(2007年)所取代。笫二代与第一代HCV国际标准物质所用材料相同，对其进行稳定性与可比性研究后确认与第一代国际标准物质定值相同，为100 000IU／ml。而新近使用的第三代HCV国际标准物质材料则与之前不同，它是由抗HCV阴性而HCV-1a RNA阳性的血浆稀释所得，候选物有3种：2种冻干与1种冷藏形式。NIBSC牵头组织了14个国家33家实验室对此候选物进行标定，最终推荐冻干样本2(06／100)作为第三代HCV国际标准物质，检测结果显示实验室间变异系数(CV)小于5％，定值为154 881IU／ml，供体外诊断厂商与I临床实验室作为定值参考。
随着HCV国际标准物质使用的增加，其储量持续减少，为了满足日益增长的市场需求，亟须建立新的HCV国际标准物质供各方使用。相关研究也于2010年12月份启动，至2011年2月份结束，初步分析数据表明其平均值约为260 000IU／ml，随后提交WHO相关部门以供审核，在2011年10月份WHO会议上建议作为HCV RNA第四代国际标准物质使用。
以上简单回顾了WHO HCV国际标准物质的建立及其发展过程，可见国际标准物质的建立过程十分复杂，包括候选原料的制备、保存方法的确定、国际范围内协作标定、统计分析确定活性单位，直至最终通过WHO技术报告，这对其他国际标准物质的研发具有很好的借鉴意义。在第一个HCV国际标准物质建立后，相关感染性病原体核酸扩增的国际标准物质开发也已取得很大进展，当前WHO已经或即将建立的分子诊断国际标准物质还有HIV、HBV、甲型肝炎病毒(hapatitis a virus，HAV)、细小病毒B19、恶性疟原虫、人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)、HCMV和EB病毒(epstein-barr virus，EBV)等，通过NIBSC向全世界分发和使用。
二、遗传性疾病相关的分子诊断国际标准物质
标准物质对于遗传性疾病的体外分子诊断必不可少，它不仅可用来校准试剂，还可对检测方法进行评价，从而有效减少实验误差，提高检测结果的准确性。分子诊断发展初期，因为缺乏经过认可的国际标准物质，大多数实验室只能使用剩余的患者样品作为参考，但此种物质不易获得且来源有限，不能在临床实验室中得到大范围推广，这大大限制了遗传性疾病分子诊断技术的临床应用。为了建立统一规范的国际标准，有力推动遗传性疾病分子诊断的快速发展，急需建立相应的国际标准物质以供临床使用，目前已取得一些不错的进展。
2004年，WHO建立了第一个遗传性疾病分子诊断的国际标准物质，用于莱顿第五因子(factor V Leiden，FVL)基因分型。它包含3种基因组DNA：03／254(野生型FV)、03／248(杂合体FVL)和03／260(纯合体FVL)，是从患者淋巴细胞系中提取纯化制得。因淋巴细胞已经EBV病毒转化成为永生细胞系，故可为标准物质的制备提供稳定的原料来源。此候选标准物质经41家国际合作机构共同评价其实用性，结果表明它非常适用于FVL的基因分型。经国际止血血栓学会(International Societyon Thrombosis and Haemostasis，ISTH)和WHO生物学标准化专家委员会(The Expert Committee on Biological Standardisation，ECBS)联合推荐，WHO在2004年建议将其作为FVL基因分型的国际标准物质使用。
在FVL的国际标准物质建立后，经过多个组织的协作努力，一系列其他遗传性疾病相关分子诊断的国际标准物质也进入研发阶段并不断获得认可。在过去的几年中，WHO已先后建立的遗传性疾病分子诊断国际标准物质有凝血素突变基因G20210A、血友病A、脆性x染色体综合征、Prader-Willi综合征和Angelman综合征、RhD／SRY血浆DNA敏感性标准物质等，它们大多是从源自患者的转化细胞系中提取纯化基因组DNA并冻干保存的。同时，遗传性血色病、红细胞抗原分型、血小板抗原分型等其他几项国际标准物质的研究已进入最后阶段，预计在不久的将来即将获得认可而用于遗传性疾病的分子诊断。
三、肿瘤相关的分子诊断国际标准物质
受益于人类基因组研究的飞速发展，重大疑难疾病研究和应用有了新的方向，肿瘤疾病也开始步人分子诊断时代。美国临床肿瘤学会(AmericanSocietyof Clinical Oncology，ASCO)公布的多个临床实验已证实，通过检测肿瘤组织中的体细胞突变、mRNA表达水平和基因分型等，能为临床个体化治疗提供科学依据，从而显著提高药物治疗的有效率，降低毒副作用。目前，围绕肿瘤个体化治疗的多种检测方案已经进入肿瘤临床诊疗规范。但是相对感染性和遗传性疾病而言，当前用于肿瘤分子诊断的国际标准物质更为缺乏，这使得肿瘤临床分子诊断的标准化缺失。为了保证诊断结果的准确与可靠，提升肿瘤分子诊断的价值，必须尽快建立相关检测项目的国际标准物质。
经过十多年的不懈努力，肿瘤分子诊断的国际标准物质终于取得了突破性进展，WHO在2010年宣布认可了第一个肿瘤分子诊断国际标准物质。它适用于慢性髓性白血病的检测，主要成分是冻干细胞系，分别含有4种不同水平的BCR—ABL mRNA基因。在此国际标准物质建立之前，不同实验室应用实时荧光定量PCR检测此疾病结果差异显著。
为了使得检测结果可溯源至同一标准，研究人员努力开发相关认可的参考物质。通过制备不同浓度的冻干K562和HL60细胞，得到BCR／ABL融合基因定量检测的候选国际标准物质，将其在10多家国际参考实验室中进行测定，结果证实其可有效提高实验室间结果可比性，同时对其进行不同百分比的定值。经WHO会议认可，此物质可作为慢性髓性白血病分子诊断的国际标准物质使用。目前WHO仅有一种适用于肿瘤分子诊断的国际标准物质，它的建立填补了肿瘤分子诊断国际标准物质的空白，也为其他肿瘤分子诊断国际标准物质的开发打下了坚实的基础。在此国际标准物质建立后，WHO将很快建立另一个肿瘤分子诊断的国际标准物质，用于结肠癌分子诊断检测。
四、人工合成的国际标准物质
当前所用的国际标准物质是经过认定，用接近天然基体的生物材料制备而成，用来校准、对测量方法进行评价或为物质定值。它的建立过程十分复杂且数量有限，一般仅作为一级标准品，可供使用10～20年，需定期更换，此过程耗时耗力。同时某些病原体存在自身问题，如难于培养、具有生物传染危害性等，这对相关机构提供稳定可靠的分子诊断国际标准物质带来了新的挑战。为了克服上述问题，建立成分单一且稳定供应的国际标准物质，WHO从未停止对理想国际标准物质的探索。早在2002年，即有专家在WHO会议上提出采用人工合成方法生产国际标准物质，随即开展了一系列相关研究。
研究的焦点首先集中在HCV候选国际标准物质的人工合成。虽然先前研究已经表明HCV国际标准物质可以显著增加实验室间检测结果的可比性，然而HCV病毒不仅难于培养，且有生物传染性，还缺乏病毒定量的独立方法(如有限稀释法)，因而需要人工构建更为理想的HCV国际标准物质。首先使用的人工合成物质是体外生成的HCV RNA转录子，它含有HCV病毒分子诊断的所有靶序列，通过与标准磷酸盐缓冲液比对而定量。在不同实验室问采用不同的分析方法发现其值不超过10，说明此合成的转录子具有成为HCV国际标准物质的潜质。在2007年，另一种HCV人工合成物质也用于国际标准物质研究，它将HCV的cDNA序列构建于特定质粒中的MS2噬菌体基因组下游，经转化细菌表达得到内含特定RNA的病毒样颗粒，且具有耐RNase特性。它作为候选国际标准物质其具有如下优点：(1)无生物传染危害性；(2)稳定性好；(3)对真正病毒核酸的提取有很好的模拟作用。研究表明相比其他生物材料，其在核酸提取过程中的回收率高，且定量更为精准。同时因其供应量大，可将人工合成物质与已有的国际标准物质间建立相关联系，作为二级参考物质供临床使用。
在HCV人工合成候选国际标准物质成功开发后，HCMV人工合成国际标准物质的研发也取得了很大进展。它是由美国国家标准技术研究所(National Institute of Standards and Technology，NIST)研制，将HCMV基因组通过同源重组方式插入到细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)上，所用毒株为Towne株。实验室用毒株在体外培养时常会产生基因序列缺失而导致假阴性检测结果，而此Towne BAC可提供稳定的含一致序列的病毒DNA，这对于HCMV的实时定量荧光PCR检测非常重要。并且此标准品的定值采用最新的数字PCR技术，可绝对定量并溯源至国际单位制摩尔，这种方法的使用也是此候选HCMV标准参考物质获得认可的关键因素之一。这两种人工合成标准物质的开发为其他相关疾病的国际标准物质的研发提供了新的思路，将会大大推动其他人工合成国际标准物质的建立。
五、当前进行国际标准物质开发的主要机构
当前世界范围内90％以上的生物学标准物质由NIBSC研制并分发，它是WHO的国际标准物质供应中心。相对应的，它也成为提供分子诊断国际标准物质的最大机构，主要提供包括感染性疾病、遗传性疾病和分子肿瘤学等领域的相关国际标准物质，供广大厂商与临床分子诊断检测作为定值参考。除NIBSC外，当前还有许多其他机构在进行相关国际标准物质的开发与溯源方法的建立，主要包括NIST、欧盟标准物质和测量研究院(The Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM)、美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)和基因检测参考物质协作计划(Genetic Testing Reference Materials Coordination Program，GeT—RM)等。它们在分子诊断国际标准物质的研发中已取得一定的进展，可提供部分包括感染性疾病、遗传性疾病、分子肿瘤学及药物基因组学等相关的标准物质，从而为临床分子诊断的标准化打下了良好基础。
六、结语
不管用何种方法测定同一临床标本中特定物质的量值，均可通过国际标准物质将其溯源至同一标准，从而使不同实验室间检测结果具有可比性。在临床分子诊断中，应用可靠的标准物质是得到高质量检测数据的前提和保证，也是做出完整科学结论的基础。随着人类基因组计划的完成和生物信息学的快速发展，分子诊断检测项目13益增多，但因标准物质制备困难、建立过程复杂、需要较大投入等问题，相应的国际标准物质的供应却十分有限，远远不能满足当前市场的需求。为了保证分子诊断的检测质量，需要及时建立新的国际标准物质，多个国际组织正致力于新的分子诊断国际标准物质的开发，在这开发过程中也面临着一些困难以及新的挑战。在科研工作者的共同努力下，我们相信分子诊断技术的进步必将克服重重阻碍，如最新发明的数字PCR技术已能从根本上解决传统技术难以解决的核酸量值的绝对定量问题；另外多基因遗传病的发现越来越多，相比单基因遗传病，其标准物质的建立需要更为复杂的方法，GeT-RM采用基因芯片技术和全基因组测序技术来研发多基因遗传病标准物质，从而有望解决多基因遗传病标准物质开发这一难题。相信在不久的将来，经认可的适用于临床分子诊断的国际标准物质将会越来越多，它们将对临床分子诊断的标准化检测起到积极作用，为临床正确诊断和合理用药提供重要依据。
编辑：范伟伟
