摘要：本文介绍了即时检验（POCT）在血小板功能检验中的应用，并论述了各种血小板功能检验技术的检测原理和技术差异。
关键词：即时检验 血小板功能 检测方法
循环中的血小板不仅在维持正常生理性止血功能中发挥着关键作用，在动脉粥样硬化、不稳定性心绞痛、血栓形成等病理过程中也关系着治疗的效果和疾病的转归。因此，血小板功能分析对于出血性疾病的筛查、早期发现血栓形成危险，以及临床相关疾病的诊断和治疗有着重要的意义。
POCT （Point-Of-Care Testing）现多译为即时检验，是指在患者床旁或诊治现场进行的一种快速检测分析技术，具有设备体积小、便于携带，以及操作简单和结果快速等诸多优点，因其时效性和便携性，获得了临床医生的青睐并被广泛应用。随着对心血管疾病（ 特别是冠心病） 临床研究的深入，抗血小板药物治疗得以广泛应用，这就对血小板检测技术提出了更多和更高的要求。POCT 在血小板功能检验中的应用发展很快，多种新颖的检测技术相继在国内出现并得到了较好的应用，如PFA-100、TEG及改良后的TEG、Sonoclot、VerifyNow和Plateletworks等。面对这些新技术，在解决干扰因素的同时，如何因人因病施药是心血管疾病实现个体化医疗的一个重要机遇，也是检验工作者面临的一个严峻挑战。
一 原理和技术差异性使POCT技术各有所长
虽然上述技术全都能够分析血小板的功能并取得了不错的临床效果，但使用者还是应该本着客观的态度去理解和判断这些技术的差别，而不宜简单地通过量值分析来判断孰优孰劣。
可以说PFA-100 （Siemens，德国）是临床应用较早且最为常见的全血快速测定血小板功能的仪器。通过模仿体内血管损伤时的止血环境，系统由微处理器控制，可定量测定高切变力下的血小板和与血小板相关的止血功能。将0.8ml 枸橼酸抗凝血加到一次性反应杯内（ 要求4h 内血样） ，反应杯中间放置一层硝酸纤维膜，膜上包被胶原蛋白和肾上腺素（Col/EPI） 或胶原蛋白和ADP（Col/ADP），预温到37℃后，利用真空吸力使抗凝的全血通过一个直径200mm的不锈钢毛细管，流经膜上直径为150mm的微孔。在5000~6000/s的高切变和诱导剂的作用下，血小板通过GPIb/IX/V和VWF间的相互作用，以及GPIa/IIa和VWF的直接连接粘附到膜上的胶原蛋白上，导致聚集；然后，粘附在胶原上的血小板被ADP或肾上腺素进一步活化，形成血小板栓子。血小板产生聚集，阻碍血液穿过微孔，最终将微孔阻塞。仪器自动记录微孔完全阻塞的时间，即封闭时间（Closure Time，CT），最大测定值为300s。
在过去的60年里，血栓弹力图分析仪（Thrombelastography，Hemonetics，美国） 的发展先后出现了两次大的技术和应用理念的更新，但其结果的判读仍然是通过图形量化来了解血液体外凝集（和纤溶）过程中的血块动力学变化。其主要检测部件包括一个恒温槽和一根链接传感器的金属探针。当样本杯放入槽中加载样本后，恒温槽以4?45\'的角度旋转，每一周转动持续10s。杯盖有一个圆柱体向下伸出，杯盖上方插在金属探针上，金属探针由螺旋丝悬挂着浸泡在血样中，用来监测凝固状态；如果探针因受到血块凝固产生的力量而发生运动，那么将切割磁力线产生相应电流，被传感器转换为电信号并以2mm/min的速率记录在配套程序上形成相应的图形。反应杯旋转时，如杯内血液未凝固，探针与血液无任何旋转切应力产生，杯的运动不影响到针，图形为直线；血液开始出现凝固或凝血块开始形成时，纤维蛋白和血小板形成的凝块将反应杯和探针耦联，反应杯旋转产生的旋转切应力增大并且传递至血样中的金属探针，从而形成凝集曲线。纤维蛋白- 血小板复合物的强度能影响探针运动的幅度，牢固的血凝块使探针运动与反应杯同步进行。因此，探针的运动幅度与已形成的血凝块强度有直接关系。探针与血液之间的切应力随血凝块形成速率和强度的增大而增大，因恒温槽往复旋转，故使凝集曲线为音叉形。当血凝块溶解时，针与血凝块的切应力逐渐减少，音叉形曲线逐渐收拢。所以说，TEG的凝集曲线可以用来检测血凝块形成、溶解及整个过程的动态变化。
Sonoclot凝血与血小板功能分析仪（Sienco，美国）同样也是一款基于血块形成过程中粘弹性变化的检测仪器，不同的是没有使用弹性螺旋丝传感器，而是用管形探针悬插入血液标本中，并以低于1mm的振幅、200Hz的频率做垂直运动。测量时血液标本保温在37℃ ；当血液凝集时，血液粘滞度发生变化，探针垂直运动的阻力增大；这种变化被检测电路探知，经处理后最终转变为输出信号，在配套程序中或记录纸上反映出来。
VerifyNow（Accumetrics，美国），前身为Ul tegra 快速血小板功能分析仪（Ultegra RPFA），该检测使用枸橼酸钠作为抗凝血剂。将采血管与一次性反应舱接合后，通过微处理器驱动钢珠运动，带动血液与血小板诱导剂和纤维蛋白原包被的聚苯乙烯珠粒混匀70s；激活的血小板和包被纤维蛋白原的珠粒之间发生凝集，沉入底部，引起标本透光率的增加。通过检测某一时间段内血小板聚集所致透光率的改变，即可了解血小板活性的高低；血小板聚集拮抗剂（ 如抗血小板治疗药物） 存在时，血小板反应单位（PRU）值会迅速下降。
Plateletworks 是一种基于全血的血小板功能检测方法，其简单快捷，用血量小。该方法组合使用Plateletworks 工具包和Ichor 血液计数器（Helena Laboratories），通过比较EDTA 抗凝对照管、含胶原或ADP激活剂的枸橼酸盐抗凝管的血小板活化数目，来获得血小板的聚集率和抑制率。
从检测原理上看，上述几种方法各具特色，有的利用微孔流变学或基于血块粘弹性，有的测定标本透光率或检测血小板数目。因此，在检测对象缺乏一致性的前提下，仍一味追求量化相关未免偏颇。下面我们具体讨论各种方法的检测参数以及彼此关系。
二 临床意义相关不等同于量化相关
总体上讲，血栓弹力图能够反映患者血液系统的的低凝、高凝状态和正常凝血功能，如果检测时间充裕，还能反映纤溶功能；其表达方式包括定性（ 简明提示） 或定量分析。在14 项定量参数中临床上常用的为以下4项：
R值：主要反映凝血因子功能；
K值：主要反映纤维蛋白原转化为纤维蛋白的能力；
Angle角：反映纤维蛋白原活化的加速情况，在极度低凝时比K值更直观；
MA（ 最大振幅） ：直接反映纤维蛋白原和血小板的最大凝集力，其中血小板作用较大，约占80%，血小板的数量及功能异常都会影响MA值。
为了消除血浆中肝素的影响，以便了解患者凝血功能的实际情况，Hemoscope公司增加了肝素酶杯用于血栓弹力图检测，增加了敏感性和重复性，取得了不错的反响。
例如，通过加入激活剂F 因子（ 由蝮蛇血凝酶和血小板ⅩⅢ a 因子组成）来产生纤维蛋白网（MA值反映纤维蛋白水平）。当加入血小板激活剂AA或ADP后，会激活未被抗血小板药物抑制的血小板，并与纤维蛋白联结形成血凝块，此MA值反映纤维蛋白和活化的血小板共同形成的血凝块强度。
Sonoclot分析仪的参数包括：
（1） 激活凝血时间（SonAct），指从加入血液标本到纤维蛋白开始形成的时间，主要与凝血因子有关，反映内源性凝血系统的状况。近年来又推出玻璃珠诱导的gbACT，其检测灵敏度更高，适于低浓度水平肝素的监测。
（2） 凝血速率（Clot Rate，CR），凝集曲线的第一个上升部分，反映纤维蛋白形成的速率，间接反映纤维蛋白原的水平。
（3） 血小板功能（Platelet Function，PF），是凝集曲线的第二个上升部分，反映纤维蛋白交联后，血小板牵拉引起的血块收缩。
（4） 达到高峰时间（Time to Peak，TP） ，从反应开始到凝血曲线达到高峰所需的时间，该高峰由纤维蛋白与血小板相互作用而成，可反映纤维蛋白原水平及血小板的量及功能。
同是采用记录凝集曲线的方式，血栓弹力图和Sonoclot两种方法的主要参数貌似代表着相同的意义，但是究其实质却有时间阶段和程度的不同，由此也就不难理解为什么进行可比性的尝试那么困难。在我院进行的性能评价中，结合对两者参数内涵的理解，客观地采取相关性与符合率相结合的研究方案，不仅解决了注册过程中法规适用性的问题，也对两种方法取得了更深的认识。相关文献也支持TEG和Sonoclot监测血小板功能时的不等效性，但是我们不提倡有效或者可靠性的说法，因为每种方法有各自的适用范围，用于同一病种的判别时是不对等的。
实际上，单纯上述4项血栓弹力图参数并不能量化反映血小板功能，还需要利用2004年获得专利的一项新技术 —— PlateletMapping?（ 血小板图），而该技术与PFA100/200和VerifyNow虽同为血小板功能的量化指标，但是彼此差异很大[18]。比如，PFA100 的CT更侧重于血小板功能缺陷的筛查，由于每项反应都有胶原的参加，实际上不能单纯反映肾上腺素或ADP诱导的血小板活化；PFA200的P2Y反应杯则直接针对氯吡格雷疗效，具有较高的特异性；VerifyNow自诞生伊始就采用单一激活模式，具有较强的特异性，但是其活化单位的概念与其他方法相去甚远，只能自成体系，比较评估时使用临床符合率更为适当。
三 现有技术的方法学评价
临床止凝血检验的基本项目包括PT、APTT、FIB、TT和血小板计数（PLT），其中前4 项反映凝血因子的数质量。但是不能反映整个凝血系统活化的过程；血液细胞学分析中的血小板计数只是定量检验，并不能反映血小板的活化功能。因此，在一定程度上，仅用这些指标进行术前凝血功能筛查是存在局限性的。
当然，用于血小板功能分析的还有血小板聚集仪，而且堪称血小板功能检测的“金标准”；但是，由于影响因素多、重现性较差，必须严格控制各种条件才能取得满意的检测结果，其临床应用受到一定制约，不适合在患者近旁使用；再则，用仪器检测血浆透光率的变化来判断血小板的聚集功能（血小板聚集时透光度增加），毕竟与全血条件下或生理状况下的真实过程存在差额，而且需血量多、分析前标本处理繁琐、对操作技术有较高的要求，只适于在实验室中进行，不适合床旁检测。
与血小板聚集仪迥异的是，POCT型血小板功能分析的共性就是相对标准化，主要是反应条件和检测过程受到人为干扰少，从而保证了结果的重现性。虽然在检测原理上差异较大，但是POCT技术多基于全血标本，最大限度地反映了生理条件下多种因素共同参与、彼此交互的真实过程。值得一提的是，由于部分方法采用了连续检测的理念，全面记录了血液凝集过程，实现了体外动态监测，容易发现个别环节的缺陷，而且为临床或基础研究提供了可能。然而，客观地说，采用终点法判读结果具有简单明了，易于被临床医生接受的优势。POCT 数据采集程序的升级使检测更为严密和可靠，并通过改良硬件克服了传统方法的缺点和局限性，使方法更趋于标准化，基本实现了性能稳定、重复性好的目标。
研究认为，TEG血小板图在评估抗血小板药物效果方面与光学聚集率紧密相关，甚至TEG与大多数常规凝血试验较明显的相关性也见于TEG的MA 与血小板聚集率测定之间。Bochsen等对43例健康人进行的初步研究显示，用TEG测量的血小板功能结果的误差≤5%。TEG和经典的光学法血小板聚集功能之间具有高度的相关性。
Sonoclot检验用于预测术后凝血功能障碍的灵敏度和准确性可能优于常规凝血功能检验。有报道称Sonoclot测定的达峰时间与胶原诱导的血小板凝集性、血小板计数和纤维蛋白原水平呈多元线性相关（r =0. 742），从而为在床旁快捷准确地检测凝血和血小板功能提供了一种可行的技术手段。
VerifyNow不仅与光学法血小板聚集有良好相关性，其敏感性和特异性也很高，分别达92%和85%，但是可能会受到糖蛋白、IIb/IIIa、ADP拮抗剂、链激酶等药物影响；Plateletworks也与血小板聚集率测定有很好的相关性，其敏感性>85%，特异性>90%。上述方法的简要比较如表所示。
四 结语
POCT进入国内市场已经十余年了，却仍然保持着旺盛的活力，新产品、新技术不断涌现，促进了检验医学的横向发展，也成为联系检验医学与临床应用的新纽带。在血小板功能分析上，POCT的优势可能体现得比在其他领域更为充分，不仅因为其快速、便捷，还由于其提高了重复性和标准化，使结果更可靠，为药物治疗提供了准确依据，进而大大降低了支架内血栓的风险。这不仅减少了住院时间、降低了医疗费用和病死率，也提高了患者的生存质量。
由于篇幅所限，本文未能对POCT型血小板功能分析广泛的临床应用展开讨论，关乎POCT生存的质量控制部分也未涉及，这些内容笔者将另文阐述。就目前发展状况来看，业者或实验室如何客观看待各种技术之间的差异性，以及如何理解部分病例的特殊性，或许是推动POCT临床应用的首要任务，也是笔者撰写本文的初衷。总之，血小板功能即时检验为止血与血栓学检验带来了前所未有的契机，正确合理地引导或促进该技术的发展是我们肩负的重要责任，也是必须面对的严峻挑战。
编辑：范伟伟
