南方医科大学南方医院普外科 刘峰，郭久冰，沈智勇，牟廷玉，智鹏柯，李国新
摘要：目的 筛选和鉴定结直肠癌腹膜种植转移相关基因。方法 收集手术切除3例伴有腹膜种植转移的结直肠腺癌病人原发病灶和正常黏膜的新鲜组织标本，提取总RNA，经逆转录合成cDNA后经体外扩增合成aRNA，Cy3荧光分子标记后和人类全基因组表达谱芯片杂交，采用经验贝叶斯方法（P≤0.05）筛选出差异表达基因，并用RT-PCR实验对部分差异表达基因进行验证。结果 满足（P≤0.05）的基因共有105个。其中和正常组织相比，在肿瘤组织表达上调的基因有42个，表达下调的基因有63个。通过生物信息学分析，在表达上调基因中选择3条（S100P；PRDX1；SLPI）基因进RT-PCR行验证，结果与芯片结果完全相符。结论 基因芯片技术通过筛选结直肠癌腹膜转移过程中发挥关键作用的基因，为寻找结直肠癌腹膜转移的分子标志物提供依据和参考。
关键词：结直肠癌；腹膜转移；基因芯片
腹膜种植是结直肠癌常见的转移方式，大样本报道结直肠癌的腹膜转移发生率约13%，有7%的结直肠癌患者在首次手术时就发现有腹膜种植转移，另有4%~19%的患者在根治术后出现腹膜种植转移。结直肠癌腹膜转移的预后很差，中位生存期只有5~9个月。因此，鉴定结直肠癌腹膜转移的生物学标记对早期诊断及判断预后都具有重要意义，基因芯片技术由于具有高通量检测基因表达变化的特点，因此被广泛应用于肿瘤生物学标记的筛查。本文拟采用全基因组表达谱芯片筛选结直肠癌腹膜转移相关基因，并用real-time PCR验证。
1 材料与方法
1.1 标本收集
2010年4月~2010年12月在南方医科大学南方医院手术治疗结直肠癌伴腹膜种植转移病人14例，其中男10例，女4例。年龄33~71（49.6±3.1）岁。盲肠3例，升结肠6例，横结肠1例，降结肠2例，直肠2例。术后病理证实腺癌6例，粘液腺癌4例，腺癌伴部分粘液腺癌4例。术中取腹膜转移组织送病理检查，术后证实为腺癌或是粘液腺癌转移。术前均未行放化疗。取原发肿瘤组织和距肿瘤10 cm处取正常黏膜组织，侵入RNA later保护液中常温过夜后存于-80 ℃冰箱待用。
1.2 组织标本总RNA抽提
在腺癌病例中选择结肠癌2例，直肠癌1例，均为中分化腺癌。取原发肿瘤和正常黏膜的组织标本块剪成0.5 cm 小块，按体积比10∶1 加入适当体积的预冷的Trizol 裂解液（GIBCO，美国），采用Qiagen RNeasy minikit（QIAgen，美国）进行总RNA的抽提和纯化，总RNA的抽提和纯化严格按照试剂盒提供的标准实验流程书进行。采用琼脂糖凝胶电泳对总RNA的纯度和质量进行评估，只有28S/18S rRNA条带清晰，D260/D280吸收率比值为1.8~2.2者才用于之后的实验。
1.3 RNA扩增及标记
每个样本取2 μg总RNA在20 ml 的反应系统内应用反转录酶（Invitrogen，美国）合成第一链cDNA并用DNA聚合酶进一步合成双链cDNA，合成的cDNA经QIAquick PCR Purification kit（QIAgen，美国）纯化后进行体外扩增反应，利用T7多聚酶在20 μl反应体系中转录合成aRNA 后，用活化的Cy3 荧光分子（GE Amersham，美国）对样品进行标记，标记后的样品经过纯化（QIAgen，美国）后进行荧光标记的测定，合格的样品即可用于芯片杂交。
1.4 芯片杂交和信号检测
标记的aRNA样品与人类基因表达谱芯片进行单通道杂交，芯片杂交采用Fullmoon芯片提供的杂交缓冲液以及推荐的实验流程进行。杂交完成后利用扫描仪(LuxScan 3.0，北京博奥)进行扫描，采用GenePix pro 6.0软件（Axon，美国）进行数据转化，转化后的荧光信号数值后进行数据分析和处理。
1.5 生物信息学分析
1.5.1 基因芯片表达谱数据的筛选 探针对应的目标基因在每个样品中表达水平由该探针点上的杂交信号强度表示，计算方法为每个点的荧光扫描前景中位数值F532（CY3）减去背景中位数值B532（CY3）。剔除芯片空白点，选取信号强度大于平均的空白点信号强度加上三倍的空白点标准差的数据点作为有效的数据点(大致相当于统计学意义上的97.5%的可信度范围)。通过背景校正，6个芯片有效表达数据文件之间归一化，对数转换对有效表达数据进行预处理。
1.5.2 选取差异表达基因 R平台中的limma package使用的统计分析方法是经验贝叶斯法（Empirical Bayes），经验贝叶斯方法是非参数法，适合小样本量的数据分析。运用此法在有效表达数据的基因中以P=0.05为阈值来挑选差异表达基因。
1.6 实时定量RT-PCR验证
对6例腺癌患者的原发灶与正常组织，采用上述方法抽提总RNA。从筛出的差异基因中选取在肿瘤组织中上调且与肿瘤转移相关的基因采用RT-PCR方法验证。总RNA 样品经反转录后进行PCR 检测，采用Roche 公司的FastStart Universal SYBR Green Master kit 检测试剂盒在ABI StepOne plus上进行基因表达荧光定量分析，按照标准的操作流程完成实验部分，实验结果以不同检测反应的循环域值（CT）进行计算，并以各自样品的内参照基因ACTB 的CT 值进行校正，目标基因在样品间的表达变化以各自的CT差值进行计算。
2 结果
2.1 RNA提取结果
1~3号标本，原发和正常RNAD260/280均位于1.8~2.2之间，经电泳鉴定，质量合格可用于芯片制备。
2.2 差异表达基因生物信息学分析结果
2.2.1 差异基因的注释和基因富集分析 满足P≤0.05的基因共有105 个。其中和正常组织相比，在肿瘤组织表达上调的基因有42 个，在肿瘤组织表达下调的基因有63 个。本研究通过DAVID（The database for annotation, visualization and integrated Discovery）分析工具来进行基因功能的注释和基因富集分析。初步的分析结果，富集分数最高的前四个类别分别是细胞迁移，膜界囊泡，氧化还原反应，肽酶水解酶活性。进一步分析这四个聚类，我们锁定了3条感兴趣的基因，它们分别是S100P；PRDX1；SLPI。在利用GO TERM FINDER工具发现了它们均在protein binding类中（图1)。
2.2.2 共表达网络的构建 用GENEMANIA 工具对S100P；PRDX1；SLPI 三个基因进行共表达网络的构建，发现三个基因在网络中有共表达趋势，SLPI 在S100P和PRDX1中起到桥梁的作用（图2）。
2.3 RT-PCR验证结果
对S100P、PRDX1、SLPI进行RT-PCR验证。芯片表达值和RT-PCR表达值的均值对数值的柱状图显示三个基因的表达值具有线性关系，比例系数中位数为1.27（图3）。RT-PCR结果显示目标基因在样品间的表达水平差异与芯片结果相符。
3 讨论
本研究通过基因芯片技术对已出现腹膜转移结直肠癌病人的原发肿瘤组织和正常组织mRNA表达水平进行检测，发现在肿瘤组织中明显上调基因有42条，下调基因63条。从中选取三条表达上调且和肿瘤进展相关的基因（S100P；PRDX1；SLPI）作为下一步研究目标，通过RT-PCR验证，无假阳性结果。
利用GO TERM FINDER工具对这105 条差异表达的基因进行分类，发现S100P；PRDX1；SLPI这三条基因同时位于protein binding term（GO:0005515），其中，S100P 为钙依赖连接蛋白，SLPI 为酶连接蛋白，PRDX1为抗氧化蛋白，它们参与转录调节，影响基因表达，调节大分子代谢过程。同时通过基因共表达网络的构建，发现S100P；PRDX1；SLPI三条基因有共同表达趋势，两条基因在图中相连说明它们在同一条件下基因表达水平相近。本研究发现在出现腹膜转移的结直肠癌原发肿瘤组织中SLPI与S100P、SLPI与PRDX1共同表达上调。
在这些基因中，目前研究较多的是S100P。S100P蛋白属于EF手型钙结合蛋白S100家族，S100P蛋白广泛分布于正常人体组织中，特别在胎盘、肺脏、心脏、骨骼肌、脾脏和淋巴细胞中表达水平较高，在这些组织中S100P蛋白参与钙离子信号转导过程和细胞活化。目前研究表明S100P蛋白在许多肿瘤组织中表达升高，并且S100P蛋白的高表达和肿瘤的进展、转移密切相关。Fuentes等研究表明SI00P蛋白及mRNA在结直肠癌组织中的表达明显高于正常对照组织，体外试验证实S100P可促进肿瘤细胞的增殖和移动，提示S100P在结肠癌发生发展中起到重要作用。但S100P高表达与结直肠癌腹膜转移的关系尚不明确。本实验通过基因芯片和RT-PCR进一步证实了在已出现腹膜转移的病人结直肠癌原发肿瘤组织中S100P的表达明显高于正常组织，据此可以初步推断S100P可能参与了结直肠癌的腹膜转移。Koltzscher等研究发现S100P作为细胞支架蛋白-埃兹蛋白的活化剂，调节细胞间或细胞与基质间的黏附，使细胞间黏附性下降，增加细胞的运动性和侵袭性，从而使一些具有明显异质性的肿瘤细胞从肿瘤原发部位脱落，最终形成转移的种子。另外，Fuentes等研究发现S100P通过与晚期糖基化终末产物相互作用，激活下游的ERK1/2 信号传导通路，使NF-κB活化而促进肿瘤细胞生长、浸润和转移。因此，S100蛋白通过赋予肿瘤细胞更强的运动和浸润能力参与结直肠癌转移的发生。
分泌型白细胞蛋白酶抑制因子（SLPI）属于内源性免疫相关蛋白，在呼吸道、消化道和生殖道等粘膜上皮及中性粒细胞和巨噬细胞内表达，SLPI与肿瘤的关系目前报道不一，Bouchard 等在综述中报道了在胰腺癌，甲状腺乳头状癌，宫颈癌，子宫内膜癌和卵巢癌组织中SLPI高表达，而在鼻咽癌，膀胱癌和某些乳腺癌组织中则低表达。目前，不同肿瘤之间SLPI基因差异表达的原因不详。SLPI与结直肠癌的关系目前鲜有报道，本研究发现，与正常粘膜组织相比，已发生腹膜转移的结直肠肿瘤组织中SLPI mRNA的表达明显上调。Devoogdt等在体内实验中发现，SLPI mRNA和蛋白表到的上调可以增加癌细胞的恶性度，加速其转移。因此，SLPI 和结直肠癌的发生、进展之间的关系有待进一步研究。
Peroxiredoxin1（PRDX1）属于抗氧化蛋白超家族。该蛋白主要作用是通过硫氧还蛋白还原、清除过氧化物或超氧化物。另外，PRDX1作为一种增殖相关蛋白参与细胞增殖和分化。Park 等的研究发现，PRDX1 在肺癌肿瘤组织中表达明显高于正常组织，PRDX1表达的上调被认为赋予肿瘤细胞适应微环境的能力，从而有利于肿瘤细胞的生长，增殖。但Quan等对膀胱癌的研究中发现，虽然在肿瘤组织PRDX1表达明显高于正常组织，但同时PRDX1在无复发病人中表达高于有复发的病人。在食管癌病人中，Quan等得出了相同的结果，PRDX1作为一种抑癌基因，其高表达的病人预后较好。因此，在不同肿瘤的发生、发展过程中，PRDX1的作用机理不尽相同。目前PRDX1并不被认为只是传统意义上的抑癌基因，通过增加PRDX1表达，肿瘤细胞获得在生长过程中必须的耐受高氧化还原反应环境的能力。Bae等研究发现PRDX1转染肿瘤细胞可以抵消氧自由基诱导的凋亡。PRDX1与结直肠癌的关系文献报道较少，Rho等应用蛋白组学的方法发现PRDX1蛋白在结直肠癌组织中高表达。本研究也发现与正常粘膜组织相比，已发生腹膜转移的结直肠癌原发肿瘤组织中SLPI mRNA的表达明显上调。因此，PRDX1与结直肠癌转移的关系有望成为一个新的研究方向。
本研究通过比较已出现腹膜转移的结直肠癌原发肿瘤组织和配对正常组织的全基因组mRNA表达水平的差异，发现许多表达差异的基因，对这些基因的进一步研究，有助于筛选和鉴定肿瘤标记物为早期诊断及判断预后奠定基础。
编辑：范伟伟
