王成龙1 苏东华1 刘佼佼2 储冰峰1 李少华3 夏伟3 罗燕萍4
杨继勇4 丁红梅3 赵强3 邓斌1 席庆1 徐娟1 邵宁生3
1.中国人民解放军总医院口腔科； 2.沈阳军区总医院口腔科；
3.军事医学科学院基础医学研究所； 4.中国人民解放军总医院微生物科
[摘要] 目的 分离鉴定变异链球菌临床分离株。方法 收集高龋患者和无龋健康人口腔中牙菌斑标本进行厌氧培养，通过细菌形态学观察、生物化学鉴定、自动微生物分析系统分析、聚合酶链反应（PCR）扩增变异链球菌基因的特异性片段表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ（spaP）、葡糖基转移酶B（gtfB）和葡聚糖酶（dexA）以及基因分型等方法对获得的变异链球菌临床分离株进行鉴定。结果 从32例临床受试者口腔中分离获得46株变异链球菌临床分离株，经生物化学，自动微生物分析系统，变异链球菌的特异性基因spaP、gtfB和dexA的PCR扩增均鉴定为变异链球菌，基因分型发现其中5株临床分离株的基因型与其他菌株相同。结论 获得41株不同基因型变异链球菌临床分离株。
[关键词] 变异链球菌； 基因型； 分离； 鉴定
变异链球菌（Streptococcus mutans）是人类口腔中最主要的致龋菌。变异链球菌群中各菌种的分离与鉴定是进行龋病研究的基础。细菌菌种的鉴定方式经历了由传统的表型、血清型方法到以分子生物学为基础的基因型方法的转变。本文采用形态学、生物化学、自动微生物分析系统、扩增变异链球菌基因的特异性片段区域以及基因分型等方法对获得的变异链球菌临床分离株进行鉴定，为龋病临床和基础研究提供材料。
1 材料和方法
1.1 实验菌株
变异链球菌国际参考株Ingbritt（首都医科大学附属北京口腔医院口腔医学研究所提供），金黄色葡萄球菌临床分离株188号（军事医学科学院基础医学研究所生物化学与分子生物学研究室提供）。
1.2 病例选择
纳入标准：高龋患者，龋失补牙（decayed-mis-sing -filled -tooth，DMFT）指数≥6； 无龋健康人，DMFT指数=0。排除标准：饮食结构异常，有嗜甜食（饮）及睡前进餐等不良饮食习惯者；接受放疗和化疗的患者；舍格伦综合征患者；严重全身系统性疾病者；近3个月内服用抗生素者；接受正畸治疗者；口腔卫生状况不良者；牙齿结构异常者；涉及取样的牙体有牙髓病变、根面暴露或根面龋、未控制的牙周病变、冠或固定桥等修复体者。
根据纳入及排除标准，从临床初次就诊的患者中选取受试者，受试者的取样位点均为无龋损的釉质光滑面。采集菌斑前，均向受试者及其陪同人员说明实验目的和过程，取得同意并签署知情同意书。40例受试者参加实验，其中高龋患者26例（DMFT指数为7.40±2.07），无龋健康人14例。
1.3 菌斑采集与处理
受试者清水漱口，去除食物残渣，棉卷隔湿并用无菌生理盐水冲洗收集区，更换棉卷，隔湿，用无菌刮匙刮取釉质光滑面菌斑后，立即将其置于预先消毒灭菌，盛有1 mL改良液体Cary-Blair运送培养基，上覆液体石蜡的Eppendorf管中密封。标本在2 h内转送至实验室。所取的菌斑样本经振荡器混匀1 min后，用无菌生理盐水做10倍系列稀释。
1.4 变异链球菌的分离
1.4.1 细菌初代培养 取原液、10-1、10-2、10-3稀释液各100 μL，接种于胰蛋白酶水解物-酵母提取物-半胱氨酸-蔗糖-杆菌肽琼脂（tryptone-yeast extractcysteine with sucrose and bacitracin agar，TYCSB）培养平板内，置于厌氧环境（体积分数80%N2、10%H2、10%CO2）下37℃培养48 h，然后进行菌落形态的观察。
1.4.2 细菌次代纯化培养 将经初代培养的具有典型菌落形态的单个菌落接种于轻型唾液链球菌-杆菌肽琼脂（mitis salivarius with bacitracin agar，MSB）培养平板内，置于厌氧环境下37 ℃培养48 h，然后进行菌落形态的观察及革兰染色检查。
1.5 变异链球菌临床分离株的鉴定
1.5.1 形态学鉴定 纯化培养的细菌经革兰染色，于油镜（100×10）下观察菌体染色、形状和排列情况。
1.5.2 生化鉴定 用无菌接种环收集培养48 h的MSB培养平板表面的菌落（经镜下观察证实为纯化培养物），混悬于1.0 mL的无菌生理盐水中制成0.5麦氏浊度的均一细菌悬液。取待测细菌悬液分别滴入需要实验的盛有甘露醇、山梨醇、棉子糖、密二糖、七叶苷和精氨酸的安瓿瓶中，每瓶3滴，以进行临床分离株的糖酵解实验和水解实验，经37 ℃培养24 h后观察结果。此外，将菌悬液滴加于清洁的载玻片上后，滴加体积分数3%过氧化氢，观察有无气泡产生。以变异链球菌国际参考株Ingbritt为阳性对照，无菌生理盐水为阴性对照。
1.5.3 自动微生物分析系统鉴定 经传统生化鉴定确定为变异链球菌的临床分离株，再分别用API 20Strep鉴定条或VITEK 2全自动微生物分析仪进一步鉴定，以确保结果的准确性。实验方法参照仪器使用说明书进行。API 20 Strep的结果分别于4 h和24 h读取；VITEK 2全自动微生物分析仪的测定结果于8 h内读取。经上述鉴定方法证实为变异链球菌者，用体积比1∶1的甘油脑心浸液（brain-heart infusion，BHI）液体培养基保种，于-70 ℃冻存备用。
1.5.4 分子生物学鉴定 通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法扩增变异链球菌基因的特异性片段区域，包括表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ（surface protein antigen Ⅰ/Ⅱ，spaP）基因[3]、葡糖基转移酶B（glucosyltransferase B，gtfB）基因和葡聚糖酶（dextranase，dexA）基因，目的片段大小分别为192、517和1 272 bp。以变异链球菌国际参考株Ingbritt为阳性对照，金黄色葡萄球菌临床分离株188号为阴性对照。
引物的设计：根据GenBank提供的基因序列并参考文献，设计spaP、gtfB和dexA特异性引物（表1），由美国Invitrogen公司中国分公司合成。
以基因组DNA为模板，通过合成的特异性引物，利用PCR的方法，从中钓取目的基因片段。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。PCR反应体系：10×Taq Buffer 5 μL，dNTP（每种核苷酸2.5 mmol·L-1）4 μL， 上游引物（25 pmol·μL-1）1 μL，下游引物（25 pmol·μL-1）1 μL，基因组DNA 1.5 μL， Taq DNA聚合酶（2 U·μL-1）0.5 μL，加灭菌去离子水补齐至50 μL；PCR反应条件：95 ℃ 10 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃1 min，72 ℃ 10 min，共30个循环反应。
1.5.5 基因分型鉴定 使用OPA5引物（ 5’-AGGGGTCTTG-3’）以随机引物PCR完成基因分型鉴定。PCR反应体系：5 μL 10×Taq Buffer，300 μmol·L-1dNTP（每种核苷酸2.5 mmol·L-1），100 pmol引物，5 μL基因组DNA，5 U Taq DNA聚合酶，加灭菌去离子水补齐至50 μL；PCR反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃1 min，36 ℃ 2 min，72 ℃ 2 min，72 ℃ 5 min，共35个循环反应。扩增产物以2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，溴化乙锭染色，Photo system EAGLE EYE Ⅱ（Stratagene公司，美国）记录图像，BioNumerics数据库软件进行图像处理，经程序统一的相对分子质量标准进行校准，标定条带位置，必要时进行手工校正。每两个图像之间的相似性系数用Dice系数表示，相似性系数设定为95%。
2 结果
2.1 菌落检测及细菌形态学鉴定
菌落肉眼观察结果：细菌初代培养时，TYCSB平板上的菌落为较小的白色菌落，边界清楚（图1A）；细菌次代纯化培养时，MSB平板上的菌落为深蓝色，嵌顿于培养基内，质硬，表面粗糙且突起，边缘不齐，形成“霜玻璃”样外形（图1B）。经革兰染色，镜下观察可见，菌落为革兰阳性小球菌，多呈短链状，成对或分散排列（图1C）。
从形态学观察，26例高龋患者中22例检出变异链球菌，从其中的10例受试者分别挑取1株形态典型的变异链球菌株，另外10例受试者分别挑取2株形态典型的变异链球菌株，最后2例受试者分别挑取3株形态典型的变异链球菌株，共36株；14例无龋健康人中有10例检出变异链球菌，分别挑取1株形态典型的变异链球菌株，共10株。将上述46株形态典型的变异链球菌临床分离株依次编号（1~46号），进行下一步研究。
2.2 细菌生化鉴定
对形态学观察具有变异链球菌典型形态的临床分离株，进行传统的生化鉴定。甘露醇、山梨醇、棉子糖和密二糖的发酵实验阳性者为黄色，七叶苷水解实验阳性者为黑色，精氨酸水解实验阳性者为红色，加3%过氧化氢后产生大量气泡者为触媒实验阳性。主要生化特性鉴定见表2。46株变异链球菌临床分离株与变异链球菌国际参考株Ingbritt对各个生化试剂的反应结果相同。
2.3 自动微生物分析系统鉴定
分别采用半自动API 20 Strep鉴定条和全自动VITEK 2微生物分析仪对已经过传统生化反应初步鉴定为变异链球菌的临床分离株进行鉴定，其结果见表3。API 20 Strep结果中的鉴定百分比是将菌株的生化反应与资料库中的所有菌株比对的结果，即为鉴定概率。鉴定百分比的值越高，结果越吻合。表3中T值为同一菌株各项生化反应的典型程度，反应鉴定的可靠性；T值越接近1，菌株生化反应的程度越典型。由表3可见：国际参考株Ingbritt的鉴定概率为99.9%，T值为1，概率生物为99.00%，可信度为优质可信，说明半自动API 20 Strep鉴定条和全自动VITEK 2微生物分析仪的鉴定结果是可信的。除菌株1的T值为0.90、概率生物为94.50%，菌株2的T值为0.78，菌株3的T值为0.80、概率生物为91.15%、可信度为可信，菌株4的T值为0.90、概率生物为94.95%，菌株5的T值为0.75外，其余菌株的T值均在0.91和1之间，概率生物在95.00%和98.00%之间，可信度为优质可信或非常可信，说明经自动微生物分析系统鉴定的临床分离株1~46均为变异链球菌。
2.4 分子生物学鉴定
分别以变异链球菌国际参考株Ingbritt、金黄色葡萄球菌临床分离株188号和经鉴定为变异链球菌临床分离株的细菌基因组DNA为模板，以合成的spaP-F（R）、gtfB-F（R）和dexA-F（R）为引物，进行PCR扩增。分别将各菌株的3个PCR产物进行电泳，电泳图谱显示46株变异链球菌临床分离株及阳性对照变异链球菌国际参考株Ingbritt的扩增产物均为单一条带，其大小分别为192、517和1 272 bp（图2），与预期相同；而阴性对照金黄色葡萄球菌临床分离株188号无目的条带出现。
2.5 基因分型鉴定
使用OPA5引物以随机引物PCR扩增46株变异链球菌临床分离株基因组DNA，进行基因分型鉴定，结果显示：46株临床分离株中，有5株变异链球菌的基因型与其他菌株相同。46株临床分离株和5株与其他菌株基因型相同的临床分离株的来源见表4。去除5株与其他菌株基因型相同的变异链球菌临床分离株菌，本实验获得41株基因型不同的变异链球菌临床分离株，其基因分型分析结果见图3。图3中电泳条带上面的横线表示菌株的相似度，竖线指示的是每一个菌株及相似度相同的菌株，由此可以得出46株临床分离株基因分型的相似程度。
3 讨论
根据世界卫生组织关于龋病流行严重程度的标准，并参考其他文献，本研究将DMFT指数≥6者确定为高龋患者，DMFT=0者确定为无龋健康人。
本研究采用的研究样本为牙菌斑，取样位点为受试者口腔内无龋损的釉质光滑面。研究表明：牙菌斑和唾液样本是良好的口腔变异链球菌研究对象。本研究的目的是为了获得确实可靠的变异链球菌临床分离株，且龋病形成的先决条件是牙菌斑的形成，所以采用牙菌斑作为研究样本。研究发现：变异链球菌的定植存在部位差异性，完整的牙齿表面和龋坏牙面以及牙冠不同部位，变异链球菌的数量和比例都是不同的。为了避免因部位因素而影响菌斑中变异链球菌检出情况，本研究的取样位点均为无龋损的釉质光滑面。
口腔中的菌群数量多、种类复杂，为了能够从牙菌斑中获得变异链球菌的纯培养物，本研究采用具有选择及鉴定功能的培养基进行细菌的分离与培养。研究表明，变异链球菌和表兄链球菌（Streptococcus sobrinus，又称远缘链球菌或茸毛链球菌）是人类最主要的致龋菌，是具有相似表型特征而遗传型和分子组成不同的异源性细菌。虽然变异链球菌在人类口腔中的检出率最高，可达90%以上，但表兄链球菌的检出率也可达10%~76%，因此，本研究中细菌培养的重点在于区分上述两种细菌。研究证实，TYCSB培养基在变异链球菌培养方面与其他选择性培养基比较具有高灵敏性、高特异性及保存时间相对较长的特点，并且通过菌落形态的差异可以区分出变异链球菌与表兄链球菌。本研究在细菌初代培养时采用TYCSB培养基，发现两种典型的菌落形态，一种为较小的边界清楚的白色菌落，另一种为边界模糊的黄白色菌落。因为该培养基中添加了可以有效抑制牙菌斑中大部分细菌生长的杆菌肽和高浓度蔗糖，所以上述两种形态的菌落可能是来源于变异链球菌和表兄链球菌。虽然MSB培养基不能明显区分以上两个菌种且保存时间较短，但仍是分离培养变异链球菌时应用最为广泛的培养基；因此，本研究将具有典型菌落形态的单个菌落分别接种于MSB培养基进行次代纯化培养。次代培养后，可看到两种菌落形态：一种菌落呈深蓝色嵌顿状态，质硬，表面粗糙有突起，边缘不齐；另一种为蓝褐色，突起，表面覆盖有水滴样的盖帽状物。经革兰染色镜下观察，两种菌落均为格兰阳性小球菌，前者多呈短链状，成对或分散排列；后者长链状居多，成对或链状排列，与文献报道相近。综合选择性培养基上菌落形态及革兰染色观察所见，可以初步认定变异链球菌的菌落特征为：TYCSB培养基上为较小的边界清楚的白色菌落，MSB培养基上为深蓝色嵌顿、质硬、表面粗糙有突起、边缘不齐的菌落，镜下观察呈短链状，成对或分散排列。
为确保分离培养出的变异链球菌临床分离株的可靠性，本研究采用从传统的生化反应到自动微生物分析系统再到分子生物学等多种方法对其进行鉴定。生化反应鉴定结果显示：46株临床分离株符合变异链球菌的生化特性。API 20 Strep鉴定条或VITEK 2全自动微生物分析仪分析均为目前临床微生物检验时常用的微量快速且具有高准确性的鉴定方法，其中API 20 Strep手工鉴定条更被认为是细菌鉴定的全球标准。本研究结果显示：尽管各菌株的鉴定概率有一定程度的差别，但均被证实为变异链球菌；其中，VITEK 2分析仪的鉴定概率小于API 20 Strep的原因可能是由于两种方法对准确率的初始设置不同所致。PCR技术具有高特异性、高敏感性的特点，对于细菌的鉴定具有独特的优势。目前已经用于变异链球菌鉴定的基因片段有表面蛋白spa基因、葡糖基转移酶gtf基因、葡聚糖酶dex基因和16S rRNA基因等。spaP基因表达的变异链球菌表面蛋白能够促进该菌对牙面的黏附与定植；gtfB基因表达的非水溶性葡糖基转移酶有利于蔗糖作为底物合成水不溶性葡聚糖，后者参与了该菌的蔗糖依赖性黏附；dexA基因表达的葡聚糖酶不仅可降解葡聚糖提供营养物质，而且可以与葡聚糖结合使该菌保持更加牢固且易黏附的形式。本研究选用spaP、gtfB和dexA基因作为目的基因进行PCR扩增，结果显示：46株变异链球菌临床分离株及国际参考株Ingbritt的扩增产物均为单一条带，目的片段大小与文献报道一致，而阴性对照菌株无目的条带出现。该结果证实46株临床分离株均为变异链球菌。
经过细菌形态学、生化反应、自动微生物分析系统和分子生物学鉴定的变异链球菌临床分离株，有可能具有相同的基因型；本研究使用OPA5引物以随机引物PCR对46株变异链球菌临床分离株进行基因型鉴定，发现5株变异链球菌临床分离株基因型与其他菌株相同。研究发现：口腔中变异链球菌基因型数量与患龋情况有关，患龋者多于无龋者；口腔环境的变化对变异链球菌基因型的数量也有影响，暴露于蔗糖环境者变异链球菌基因型数量多于暴露于水环境者。本研究发现的5株相同基因型的变异链球菌均来源于同一受试者中分离培养多于1株的受试者，而不同受试者的基因型不同。经过基因型鉴定，剔除5株基因型相同的变异链球菌临床分离株后，本研究得到了41株基因型不同的变异链球菌临床分离株，可以用于龋病临床和基础研究。
编辑：范伟伟
