沈阳军区总医院检验科 薛文成 任晓庆 褚美玲 马均 任微 王璐 孟冬娅
【摘要】 目的 探讨Ｖｉｔｅｋ Ｃｏｍｐａｃｔ 微生物自动鉴定仪器对１ 例布鲁菌误鉴定原因及临床影响分析。方法 １ 例无明显诱因发热患者血培养分离菌株，采用Ｖｉｔｅｋ Ｃｏｍｐａｃｔ 细菌鉴定系统，形态学、传统手工生化对分离株进行鉴定。采用ＰＣＲ 扩增１６Ｓ ｒＲＮＡ 基因并测序，对所测得的核酸序列进行同源性比对分析。结果 从该患者血液中分离到１ 株缓慢生长的革兰阴性短小杆菌，Ｖｉｔｅｋ Ｃｏｍｐａｃｔ 鉴定仪器，ＧＮ 鉴定卡首次鉴定为支气管炎鲍特菌，基于１６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列分析表明，菌株与马耳他布鲁菌或人苍白杆菌核酸匹配度高达１００％，完全排除支气管炎鲍特菌的可能。将保存的菌株用Ｖｉｔｅｋ Ｃｏｍｐａｃｔ 鉴定仪器，ＧＮ 鉴定卡复检，结果为马耳他布鲁菌。结论 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列分析是鉴定临床非发酵革兰阴性杆菌的最有效手段，微生物自动鉴定仪器鉴定慢生长细菌如布鲁菌等有明显局限性，对布鲁菌病等传染病的临床治疗及流行病学调查可产生误导。
【关键词】布鲁菌；细菌自动鉴定仪器；误鉴定
Ｖｉｔｅｋ-ＡＭＳ（ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉｃ ｓｙｓｔｅｍ）全自动细菌鉴定和药敏分析系统，最初为美国航天局为鉴定宇宙环境中的微生物而研制，因而采用全自动封闭真空加注系统，省时、省力，自动监测细菌生化反应结果，并对生化结果编码，最快６ ｈ 左右就可报告结果。该技术被转让给法国生物梅里埃公司后，迅速在世界各国推广应用。微生物自动分析仪对各类细菌鉴定准确率有较大差异，常见的肠杆菌科细菌等鉴定准确率可达９５％以上，对于一些常见的非发酵菌，有报道Ｖｉｔｅｋ ２ 非发酵菌鉴定试剂卡加Ｖｉｔｅｋ ２ 版本４.０２ 的软件数据系统鉴定准确率可达９４.１％，辅助仪器提示的补充生化试验，准确率可提高到９７.６％。但对于不常见的非发酵菌种如布鲁菌属、鲍特菌属等鉴定效果尚未见报道。
２０１１ 年底，我科从１ 例发热患者血中分离出１ 株革兰阴性短小杆菌，初次分离菌株经Ｖｉｔｅｋ Ｃｏｍｐａｃｔ 系统鉴定为支气管败血鲍特菌，而１６Ｓ ｒＲＮＡ 序列分析排除了该菌的可能（序列对比等鉴定为布鲁杆菌），二次对保存菌株复苏鉴定，结果鉴定为马耳他布鲁菌。本文详细介绍上述鉴定分析过程，分析误鉴定原因并结合２ 种菌不同致病性，讨论误鉴定对临床治疗及疾病研究可能产生的影响。
一、对象与方法
１．对象：患者女，６３ 岁，发热伴乏力半个月，于２０１１ 年１２ 月６ 日转入我院。病程：半个月前患者无明显诱因出现发热，伴寒战、周身疼痛，无咳嗽、咳痰，体温最高达４０ ℃，就诊于当地医院，给予头孢类药物抗炎治疗后未见好转。无特殊病史，脾肋下触及５ ｃｍ，余未见异常。
２．主要仪器与试剂：法国梅里埃Ｖｉｔｅｋ Ｃｏｍｐａｃｔ 自动鉴定仪，ＧＮ 鉴定卡，批号：２４１１９１１４０。１６Ｓ ｒＲＮＡ 试剂盒（ＴａｋａＲａ １６ＳｒＤＮＡ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ）由大连宝生物工程有限公司生产，ＬＯＴ ＢＫ７０１。罗氏４８０ ＰＣＲ 扩增仪，ＢＤ９２０ 自动血培养仪器及配套血培养瓶（美国）。
３．菌株分离鉴定：取血培养阳性瓶分离菌株三区划线接种于５％羊血平板置于３５ ℃孵育箱恒温培养。每天观察平板生长状况及菌落形态。对分离菌株进行革兰染色及氧化酶实验，按照Ｖｉｔｅｋ Ｃｏｍｐａｃｔ 自动鉴定仪，ＧＮ 鉴定卡说明书严格操作，上机鉴定。根据美国临床微生物学手册２００５ 年第七版相关内容指导，补充相应的手工鉴定。
４．１６Ｓ ｒＲＮＡ 检测及测序：１６Ｓ ｒＲＮＡ 基因扩增严格按照试剂盒说明书进行，扩增产物送交大连宝生物工程公司测序。
二、结果
１．患者入院检查及临床分离株的初步鉴定：该患者转入我院后进行了详细的实验室检测，２０１１ 年１２ 月７ 日至１２ 月１６ 日共做血液分析４ 次，白细胞总数（２.７ ～４.５） ×１０５ ／Ｌ，淋巴细胞４１.１％ ～５２.４％，明显升高；呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、ＥＢ 病毒、甲型肝炎、戊型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、ＨＩＶ、梅毒、布鲁杆菌、肺炎支原体、血清结核抗体等抗体均阴性。２０１１ 年１２ 月７ 日首次降钙素原半定量方法＜０.５ ｎｇ／ｍｌ；后用罗氏免疫分析仪器定量为０畅１５ ｎｇ／ｍｌ。
该患者血培养阳性报警后转种到血平皿培养，次日可见细小菌落生长，氧化酶阳性，革兰染色呈红色短小杆菌，初次用Ｖｉｔｅｋ Ｃｏｍｐａｃｔ ＧＮ 卡鉴定为支气管败血鲍特菌，由于１２ 月７ 日抽血检测布鲁杆菌血清学实验，患者血清布鲁菌抗体阴性（小于１∶８），提示临床可能为“支气管败血鲍特菌”，结果待确认。鉴于该例患者临床有脾大等表现，白细胞总数淋巴细胞比例显著升高，对该菌株进行了１６Ｓ ｒＲＮＡ ＰＣＲ 扩增、测序。
２．１６Ｓ ｒＲＮＡ 基因检测：ＰＣＲ 扩增该菌株１６Ｓ ｒＲＮＡ 全序列，测序结果与Ｐｕｂｍｅｄ ＮＣＢＩ／ＢＬＡＳＴ 数据库进行比对分析，结果提示，该序列与Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐｐ 中Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓＡＣＢＪ０１００００７５-１；Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＡＣＥＭ０１０００００５-１；Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｉｃｒｏｔｉＮＣ＿０１３１１８-１等布鲁菌属中多个菌种及人苍白杆菌（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ａｎｔｈｒｏｐｉＡＴＣＣ ４９１８８ ＮＣ＿００９６６８-１） 序列一致性最高（Ｑｕｅｒｙ ｃｏｖｅｒａｇｅ１００％；Ｍａｘ ｉｄｅｎｔ９９）。补做动力试验阴性，可排除人苍白杆菌。
３．菌株二次重复鉴定过程对比分析：鉴于１６Ｓ ｒＲＮＡ 鉴定结果与细菌自动鉴定仪器结果不一致，将保存菌株传代培养，第２次用Ｖｉｔｅｋ Ｃｏｍｐａｃｔ 自动鉴定仪ＧＮ 鉴定卡对菌株再进行鉴定，结果提示为马耳他布鲁菌。二次鉴定详细内容见表１。
三、讨论
１．鉴定错误的原因：两次鉴定过程中的数据（表１）表明，第１ 次Ｖｉｔｅｋ ＧＮ 卡中共有５ 项生化反应结果阳性，其余均判读为阴性结果，鉴定结果为支气管败血鲍特菌，用时６ ｈ。第２ 次鉴定除上述５ 项生化反应外，又增加了４ 项阳性反应结果，ＡＰＰＡ、Ａｇｌｕ、ＧｌｙＡ、Ｅｌｌｍ，共９ 项生化反应阳性，鉴定为马耳他布鲁菌（９２％），用时８ ｈ。
张磊等用Ｖｉｔｅｋ ２ 仪器，ＧＮ 卡试剂重复对１ 株玫瑰假单胞菌鉴定３ 次，其生化编码分别为０００００１３０２５０１００１ （５.２５ ｈ），０００００１３０１５０１０００（７.２５ ｈ），０００００１３０１５０１００１ （１０.２５ ｈ），分别提示为皮氏罗尔斯顿菌（可信度９９％）、支气管炎鲍特菌（可信度９７％），以及可能为鲁菲不动杆菌与支气管炎鲍特菌的低鉴定度细菌。加拿大Ｐａｎａｇｏｐｏｕｌｏｓ 等报道，４ 年中蒙特利尔４ 例儿童血培养分离的霍氏鲍特菌（ Bordetella holmesii ）， 最初由于ＡＰＩ２０Ｅ，ＮＥ 不能给出良好鉴定，用Ｖｉｔｅｋ ２ 细菌自动鉴定仪器鉴定为洛菲不动杆菌（Acinetobacter lwoffii）。
结合上述文献报道，分析本次误鉴定原因可能有：血培养分离原代培养细菌和连续传代菌株生长速度等特性差异，导致某些生化反应速度差异，从而出现错误鉴定结果，从两次生化结果阳性数量差异部分支持这个推断；另一个原因就是现在的ＶｉｔｅｋＧＮ 卡用的样品量较少，加样、结果读数都易受到影响。最重要的细菌自动鉴定仪器无固定时间判定最终结果，这一点是造成差异结果的主要原因，只要已检测到的生化反应组合模式与数据库中某种细菌编码一致就会自动终止鉴定，给出结果，对于生长较为缓慢及生化反应模式相近的细菌种类，误鉴定概率较高。当然细菌鉴定仪器数据库的完善程度也是造成错误的重要原因 。
２．对临床的潜在影响分析：支气管败血鲍特菌、霍鲍特菌等属于鲍特菌属，该属中百日咳鲍特菌是列入国家传染病管理的菌种，而其他鲍特菌属菌种都是近二十年来陆续报道的，其致病性、传染性等都有待深入研究 。但开展研究的基础条件是对菌种的准确鉴定，否则很有可能得到相互矛盾的结论。布鲁菌属属于国家规定的必须报告的传染病，错误将布鲁菌鉴定为其他菌也会给传染性疾病的流行病学调查及疾病控制带来严重影响。
复习了国内外关于鲍特菌的文献报道，国内从１９９４ 年以来已报道８ 例支气管败血鲍特菌感染，没有１ 例报道其菌种鉴定使用了分子诊断方法，甚至未注明应用何种方法鉴定菌种。７例中，有２ 例由血培养分离，伴随单核细胞或淋巴细胞增多，其他５ 例由肺炎患者痰（１ 例另有穿刺液）分离，显示白细胞总数及中性粒细胞明显升高。８ 例患者其他临床体征如脾肿大等也差异明显，同种致病菌感染疾病临床表现可不完全一致，但关键指标如中性粒细胞升高或淋巴细胞升高属于不同的免疫反应机制，同一种病原菌感染不可能出现这两种不同机制的免疫反应，故可以判定上述文献报道中的菌种鉴定结果有一部分是错误的。国外早期报道也未用分子生物学方法诊断，同样也存在上述矛盾的临床表现。综观上述报道，提出两点意见：凡是微生物感染病例报道的文献，没有用分子生物学等可靠方法鉴定病原体的文章不能报道；再先进的自动化细菌鉴定仪器也有局限性，应进行广泛的评价性研究，临床对感染性疾病的诊断离不开病史、接触史等流行病学资料的支持。
编辑：范伟伟
