浙江大学化学系微分析系统研究所 潘建章 方群
摘 要 综述了近年来面向床边检验应用的微流控分析仪器的研究进展。针对仪器微型化过程中所面临的流体操控自动化的发展瓶颈,以流体操控方式对当前床边检验分析系统进行了分类。评述了适用于现场床边检验应用的各类流体操控方式的优缺点及适用范围,并展望了微流控床边检验分析系统的发展方向和前景。
关键词 微流控学;床边检验;分析仪器微型化;微流体操控;评述
1 引 言
床边检验(Point of care testing, POCT)又称床旁检测,是指在病人身边或附近进行的测试。由于能显著缩短样品周转时间,快速提供检验结果,POCT 已成为临床检验的一个重要发展方向。除了基本的仪器分析性能外,床边检验还对仪器的分析速度、便携性和自动化程度等方面提出了全方位的要求。微流控技术因其快速高效的分析、自动化的流体操控和易于微型化等突出特点,成为了当前推动POCT 仪器发展的主要技术。完整的POCT 操作通常包括样品的引入和前处理、试剂的储存、试剂和样品的准确量取、样品和多个试剂的顺序混合反应、分离分析等一系列繁琐复杂的过程。虽然上述过程可在不同的微流控系统内分别实现,各种检测器也已实现了微型化,但实现全系统部件和操作的综合集成仍然是一个重大挑战。微流控POCT 仪器可按照分析方法、检测器类型以及应用体系等不同方法进行分类。由于实现上述综合集成的关键之一在于贯穿整个分析过程的流体操纵和控制,因此,流体操控方法也成为制约当前微流控POCT 系统实用化的瓶颈之一。本文将依据微流体驱动操控方式的不同对当前微流控POCT 系统进行分类,重点介绍高集成度、较具商品化雏形的微流控POCT 系统。
微流控分析中常用的高精度注射泵和聚二甲基硅氧烷(PDMS)气动微阀微泵虽然具有精密的液体量取和复杂的流体操控能力,但其系统难以实现集成和微型化,因而在POCT 中的应用受到限制。目前,常见POCT 系统的驱动方式主要包括压力驱动、离心力驱动、电湿润驱动和毛细作用力驱动4 种。
2 集成化微流控床边检验系统
2.1 压力驱动的POCT系统
在集成化微流控POCT 系统中,通常使用的压力驱动模块有电解泵、压缩气体泵、化学分解泵和直接气压差驱动等。但这些泵难以提供准确稳定的液体驱动速度,无法通过控制驱动时间测量所驱动的液体体积。因此,在实际应用中,往往采用试剂预封装的方法预先将一定量的试剂溶液封装在芯片储液池内。在样品分析过程中,只需将所有预封装的试剂驱动进入分析通道即可。其原理如图1 所示,各分析试剂准确量取后储存在储液池中,每个储液池通过微通道与后方的驱动泵相连,各驱动泵可分别控制,由此可实现分析中多溶液、多步骤的复杂操作。
Liu 等报道了一种电解泵驱动的集成芯片DNA 自动分析系统。分析所需的试样、清洗液、杂交试剂和PCR 试剂等都预先量取并封装在芯片的各储液池内。各储液池通过通道连接独立的电解泵,通过电解水产生H2 和O2 ,驱动储液池内的溶液。芯片上还集成了控制各流路的石蜡热熔阀、半导体加热/制冷器、压电混合器和微阵列电极检测器。该系统实现了包括病原体捕获、DNA 提取、PCR 扩增、DNA杂交检测等多步复杂操作的自动化。此后,Liu 等又采用类似结构的芯片结合DNA 微阵列检测芯片实现了人白血病细胞(K562)基因和流感病毒的分型和部分测序。此类系统流体驱动操作简单可靠,容易实现自动化,系统集成度高。不足之处在于试样需要预封装在芯片内,未能实现试样的现场引入,这不利于POCT 系统在现场的实际应用。
Ahn 等报道了一种压缩气体驱动的,用于全血中CO2 、乳酸、葡萄糖检测的微流控芯片。芯片上集成了取样探针、试样量测单元、压缩气体微气囊、加热器、突破阀、液体分配器和生物传感器等部件。工作时,由取样探针吸取血液至充满试样量测单元,然后开启气囊下方的加热器,加热融化气囊壁释放出气体,气体膨胀驱动血液通过液体分配器分别流过3 个电化学检测器,实现3 个指标的同时检测。该系统实现了微泵的集成,有开放的试样引入口,但在流体的驱动过程中,气体释放过快导致部分溶液残留在通道内壁,而难以实现预封装液体的定量驱动。Do 等在此基础上以偶氮二异丁腈化学推进剂替代压缩空气为液体驱动源。芯片结构和驱动控制仪器如图2 所示,工作时,金属加热器加热偶氮二异丁腈,使其受热分解产生氮气,氮气推动样品池内的血液通过电化学检测器。通过控制加热时间和加热温度(电流),能较好地控制流体的流动速度。该系统成功用于血液中乳酸、血氧和葡萄糖3 个指标的同时分析,真正实现了分析过程的全集成和自动化。Linder 等用负压抽吸预封装液段的方式实现了固相免疫分析的多步操作。分析前,在一段聚乙烯管内以气相间隔液段的形式,预先存储免疫分析所需的各种试剂。分析时,通过注射器抽吸的方法驱动各试剂顺序通过固定了免疫试剂的微通道,实现多步固相免疫分析操作。该系统被成功用于艾滋病病毒的免疫测定。Liu 等用简单的发条定时器带动滚珠挤压芯片气囊的方法实现了多溶液的顺序定时驱动。发条定时器的转子底部安装有突起的滚珠,各滚珠位置对应芯片上各试剂的驱动气囊,转子转动可实现定时挤压各气囊,气囊受压后驱动对应液池的溶液流向反应池。该系统成功用于唾液中HIV 抗体的测定,其优点在于以简单可靠的方式实现了不同的微量溶液的定时驱动。
2.2 离心力驱动的POCT系统
离心力驱动是微流控系统中一种独特的驱动方式,其系统通常由圆盘形芯片、驱动电机和检测装置构成。芯片工作原理如图3 所示,芯片上可以加工多个微流控分析单元进行并行分析。各种试剂和试样预先储存于芯片的各储液池中,各液池都开有进气口并与主通道相连。储液池出口设计有被动突破阀,突破阀的结构通常为一局部憎水的微通道或具有特殊结构的微通道(如通道截面由小变大或鱼骨状结构的微通道)。突破阀的开启决定于微通道的尺寸、通道表面的憎水性质、流体的特性和驱动电机的转速等因素。工作时,由于各液池距离芯片转轴轴心的距离不同,所受的离心力也不同。同一转速下,离转轴远的储液池内溶液因受的离心力最大,率先突破阀的阻隔进入主通道。随着转速的提高,离转轴较近的溶液再依次进入主通道。因此可通过设置液池与转轴间距和调节电机转速的方法,控制试样试剂进入相应通道的顺序和时间,完成复杂的反应操作。该方法的突出优点是只用一个电机即可实现多种流体的顺序驱动,且芯片上没有活动部件,可靠性较高,适合用于多步液体操作或并行分析的场合。但由于芯片工作时处于高速旋转状态,通常只能使用光学检测方法,难以进行电化学检测,因此其应用范围受到一定限制。
Grumann 等在离心力驱动芯片上实现了血清中血红蛋白的测定。芯片上集成了试剂、试样储液池和检测流通池。工作时,利用离心力将试样和试剂驱动到流通池进行混合反应,完成显色反应后由离心芯片上方的吸收光度检测器进行检测。Lai 等在离心芯片平台上实现了基于酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)的小鼠杂种细胞培养液中IgG 的测定。通过程序控制电机转速,顺序将试样、清洗液、荧光标记二抗、清洗液、底物、清洗液等溶液引入检测池内,完成免疫反应,芯片上共分布了24 个并行分析单元。该系统可实现ELISA 整个操作过程的自动化,但最后各检测池的荧光强度信号由一台荧光倒置显微镜读出,尚难以满足POCT 应用中对现场实时检测的要求。
虽然离心芯片平台可实现如ELISA 等复杂的流体操作,但在进行全血样品分析时仍存在较大的问题。由于全血分析第一个步骤通常都需进行血浆和血细胞的分离,在离心芯片系统中,这种分离通常需要一个相对较高的离心转速,而在系统达到这个转速前,其它试剂通常已冲破突破阀的限制而开始相互混合。
2007 年,Lee 研究组通过在离心力驱动芯片上引入光控蜡阀的方法实现全血分析。其原理是在芯片通道固定铁氧化物纳米颗粒和石蜡混合物构成蜡阀。初始石蜡为固体,阀呈关闭状态;需要开启时,用激光照射石蜡,铁氧化物纳米颗粒吸收激光能量后升温致石蜡融化,蜡阀开启。蜡阀的使用避免了高离心转速全血分离过程对其它流体操作的影响,显著提高了离心芯片对流体操控的灵活性,该系统成功实现了全血中乙肝病毒和大肠杆菌的DNA 提取及分析。2009 年,该研究组在此基础上设计了基于ELISA 方法的全血乙肝指标的分析芯片。芯片通道和仪器结构如图4 所示。芯片上分布了3 个并行的独立分析单元,每个单元内加工了多个储液池和对应的光控蜡阀,用于全血试样、清洗液、固定了抗体的微珠悬液和底物等液体的储存和控制。分析时,先实现血浆的分离,再将血浆和固定了抗体的微珠混合,然后通过清洗、酶催化显色等过程,最后将产物溶液驱动到检测池进行吸光度检测。该系统成功实现了全血中3 个指标乙肝抗原HBV、乙肝表面抗原HBsAg 和乙肝表面抗体Anti-HBs 的同时自动分析。
2.3 电湿润驱动的POCT系统
电湿润驱动是微流控技术中最为灵活的液体操控方式之一,在POCT 应用中显示出很大的发展潜力。其原理如图5 所示,芯片为上下两层结构,流体以液滴形式夹在两层结构中间进行操控。上层芯片加工有一公共的电极,下层芯片表面加工多个独立的电极,电极表面覆盖绝缘层和疏水层。下层芯片各电极可单独控制,电极通电时其表面张力减小,断电时表面张力升高。在相邻两电极间通断电,可使其表面的液滴由断电电极向通电电极移动。通过在不同电极间交替通电,可驱动液滴沿着电极排布的路径移动。由于可采用低频交流电压驱动,被操控液滴中无电流通过,所以电湿润技术可以用来驱动各种水溶液,包括复杂生物试样(如血液等)。除驱动液滴外,电湿润技术还可用来进行液滴的合并和拆分等操作,组合上述操作可实现溶液的量取、试剂和试样的混合等分析操作。
Srinivasan 等用电湿润液滴操控平台实现了血清中葡萄糖的测定。试样和试剂储存在芯片的液池中,工作时,分别从液池中取出一定量的试剂和试样形成液滴,由电极驱动液滴混合完成反应。反应后产物液滴被驱动到检测区进行吸光度检测,实现血糖的酶显色分析。
Abdelgawad 等报道了一种电湿润芯片和毛细管电泳芯片结合的细胞分析芯片。细胞溶出液、酶解液、荧光标记试剂等先以液滴形式滴加在电湿润芯片上。首先,驱动细胞溶出液与酶解液混合,再与荧光标记试剂混合,依次实现细胞溶出物的酶解和酶解后氨基酸的荧光标记过程,最后将该混合物驱动到电泳芯片的进样通道,进行毛细管电泳分离和激光诱导荧光检测。
Sista 等报道了基于电润湿芯片的多功能分析平台,能实现复杂的DNA 实时荧光定量PCR 分析和细胞磁珠免疫分析。分析芯片和配套的微型化仪器如图6 所示,分析前试样与所需试剂被预先装载在对应的芯片储液池中,可用于12 个试样的并行分析。进行DNA 分析时,定量移取DNA 试样和试剂液滴并混合,混合液滴在60 ℃和95 ℃的两个芯片温区间往复移动并用荧光检测器实时测量其荧光强度,实现了DNA 的荧光定量PCR 分析的自动化。在磁珠免疫分析中,利用电湿润效应驱动全血试样液滴与磁珠一抗液滴、二抗液滴依次混合反应,然后将混合液滴通过磁场区域实现磁珠捕获,再将清洗液和化学发光底物液滴依次驱动到磁珠位置,实现磁珠的清洗和化学发光反应,最后将溶液驱动到检测区由光电倍增管进行检测。
在上述系统中,芯片表面存在的非选择性吸附会产生液滴间的交叉污染。针对该问题,Yang 等提出了一种可更换薄膜的解决方案。在电润湿芯片表面贴覆一层薄膜进行液滴操作,薄膜同时作为电润湿系统的疏水层,每次分析后更换薄膜。试剂的预封装通过在薄膜表面滴加试剂后风干的方式实现。该法在解决交叉污染、试剂预封装以及降低单次分析成本方面有着较强的优势,但在薄膜的可靠性和一致性等方面尚有待进一步完善。
2.4 毛细作用力驱动的纸芯片POCT系统
毛细作用力驱动是微流控系统中一种常见的流体驱动方式。在POCT 领域,这种驱动方式主要应用于微流控纸芯片系统中。Whitesides 研究组在纸芯片领域进行了一系列开拓性工作,包括芯片的制作方法、流体操控原理以及检测方法等方面的研究。纸芯片通常由纸芯片基片经过疏水或亲水处理加工而成,亲水区域可以作为微流控分析通道,提供试样和试剂的储存区、反应区和检测区。纸芯片系统通常采用直接将分析试剂溶液滴加在特定区域后待水分蒸发的方法实现试剂的预封装。与当前市场上销售的POCT 试纸条系统(如血糖检测试纸条)相比,微流控纸芯片的最大优势是能实现多通道、多指标的并行分析。此外,在纸芯片系统中还易于进行具有三维结构的通道的加工。
在纸芯片的现场检测方面,Whiteside 研究组提出了一种纸芯片结合拍照手机的远程诊断系统。该系统基于显色反应,在纸芯片上几个区域预先固定葡萄糖和蛋白质的显色试剂,分析时将人工合成尿样滴加在试样区,尿样依靠毛细作用力进入到试剂区,分别反应后显色,通过手机摄像头对显色区拍照,并将照片用彩信远程传送给专业分析人员,对结果数据进行分析,获得尿样中葡萄糖和蛋白质的含量信息,实现低成本的远程诊断。此后该研究组还研制了一种采用电化学检测的纸芯片,可以利用商品化的血糖计作为检测器进行检测。芯片结构如图8 所示,芯片上加工有碳电极,电极间的检测区预先固定了硫氰化铁和葡萄糖氧化酶,试样通过试纸下端吸入检测区,试样中葡萄糖与试剂发生氧化还原反应,利用血糖仪测定反应产生的电流可获得试样中葡萄糖的含量信息。通过在检测区固定不同的酶催化剂,该系统最终成功实现血糖、乳酸、胆固醇和水溶液中酒精含量的快速分析。
3 总结与展望
综上所述,在微流控分析领域,已经发展出众多适合于POCT系统的流体驱动技术和方法,部分仪器已经出现了商品化的雏形。但从POCT 系统的实际应用角度来看,仍有一些问题需要解决和完善。如在压力驱动和离心力驱动芯片系统中,试剂多以液体形式进行封装和储存,如何在长时间储存过程中保持溶液内生物试剂(如酶或抗体)的活性仍然是一个挑战。目前,采用干粉形式储存生物试剂,分析时通过加入缓冲液现场配制试剂来保证试剂的生物活性,是一种有前途的解决方法。对于电湿润驱动系统,仍然存在着不同溶液通过同一电极表面时产生的交叉污染问题,一种可能的解决方法是通过使用可更新的电极表面薄膜来避免交叉污染。对于纸芯片,目前研究主要集中于芯片的设计和制作工艺,其系统的检测方法较为单一,多采用光度比色法。如能研制便携式电化学或荧光检测仪,则可进一步提高系统的检测灵敏度,显著拓展纸芯片系统的应用领域。相信随着相关研究的不断深入,微流控分析技术将日趋成熟,有望在近期实现微流控POCT 分析仪器在实用化和商品化方面的全面突破。
编辑：范伟伟
