河北医科大学第二医院 赵建宏，李雅静，温海楠，杨靖
非结核分枝杆菌（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ，ＮＴＭ）是指除结核分枝杆菌复合群（人型、牛型、非洲、坎纳和田鼠分枝杆菌）及麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌。ＮＴＭ常存在于自然环境中，迄今为止已发现有１５０余种，其中约１／３与人类疾病有关。近年来，由ＮＴＭ引起的感染呈逐渐上升的趋势，日益引起国内外的关注。
ＮＴＭ病在患有肺部疾病的老年患者、获得性免疫缺陷综合征（ＡＩＤＳ）患者、长期使用免疫抑制剂患者和器官移植术后患者中更为常见。结核病和ＮＴＭ病的治疗不同，因为许多一线和二线的抗结核药物对ＮＴＭ均无效，且治疗方案与分枝杆菌的类别、感染的部位及感染严重程度等许多因素相关。结核分枝杆菌与ＮＴＭ还可能发生混合感染，所以正确的进行菌种鉴定对常规治疗无效、复发及免疫缺陷的患者十分重要。早期进行菌种鉴定也可以帮助选择有效的药物及时进行治疗，降低发病率和死亡率。我们主要就ＮＴＭ感染的分子诊断研究进展进行综述。
一、ＮＴＭ分类及致病性
近年来，随着研究方法的深入，特别是分子生物学技术的广泛应用，新的ＮＴＭ菌株不断被发现。ＮＴＭ有２种常用的分类方法：一是根据生长速度分类，将其分为快速生长型和缓慢生长型，前者指１周内培养出现菌落，后者指约在２～４周出现菌落；二是依据Ｒｕｎｙｏｎ分类法将其分为４群：Ⅰ群为光产色菌，如海分枝杆菌（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）、堪萨斯分枝杆菌（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、猿猴分枝杆菌（Ｍ．ｓｉｍｉａｅ）等；Ⅱ群为暗产色菌，如瘰疬分枝杆菌（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、戈氏分枝杆菌（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、蟾蜍分枝杆菌（Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ）等；Ⅲ群为不产色菌，如鸟分枝杆菌复合群（Ｍ．ａｖｉｕｍｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＡＣ）、溃疡分枝杆菌（Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ）、土地分枝杆菌（Ｍ．ｔｅｒｒａｅ）等；Ⅳ群为快速生长菌，如偶然分枝杆菌（Ｍ．ｆｏｒｆｕｉｔｕｍ）、龟分枝杆菌（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、脓肿分枝杆菌（Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、耻垢分枝杆菌（Ｍ．ｓｍｅｇａｔｉｓ）。
ＮＴＭ可以侵犯宿主肺脏、淋巴结、骨骼、关节、皮肤和软组织等并造成全身播散，引起肺部感染的ＮＴＭ 主要有ＭＡＣ和堪萨斯分枝杆菌。此外，还有偶然分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌和海鱼分枝杆菌（Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ）等；引起皮肤和软组织感染的ＮＴＭ主要有脓肿分枝杆菌，此外还包括海分枝杆菌、偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、ＭＡＣ和耻垢分枝杆菌等；引起淋巴结炎的ＮＴＭ主要有ＭＡＣ、瘰疬分枝杆菌、偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌；引起播散性病变的ＮＴＭ主要包括ＭＡＣ、堪萨斯分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和海分枝杆菌等。
二、实验室诊断
ＮＴＭ的实验室鉴定方法主要有传统细菌学鉴定和分子生物学鉴定两大类。细菌学鉴定包括涂片检查和细菌培养。目前，分枝杆菌检查仍用萋-尼氏抗酸染色法。有些患者痰粘稠性大，部分菌体被包裹，涂片时常造成菌体染色和镜检的困难，容易出现误检和漏检；而荧光镜检法是将萋-尼氏抗酸染色法的复红改为金胺类，具有操作简便、更易于观察、受检面积大、阳性率高、效率高等优点。荧光镜检法的阳性率一般高于萋-尼氏抗酸染色法。故在实际工作中将２种方法相结合，既可提高阳性率避免假阴性又可提高工作效率。ＮＴＭ的培养是将标本接种于改良罗氏培养基和丙酮酸培养基上，并同时接种对硝基苯甲酸（ＰＮＢ）和噻吩-２-羧酸肼（ＴＣＨ）鉴别培养基，３７℃培养１～８周，根据生长速度和菌落特征作出诊断。
目前，对ＮＴＭ快速鉴定的方法包括噬菌体生物扩增法、高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）、探针法和其他的分子生物学方法。噬菌体生物扩增法检测分枝杆菌具有敏感性高、特异性好、省时、方便的优点，但也存在许多不足。ＨＰＬＣ是基于不同种的分枝杆菌细胞壁中分枝菌酸不同对其进行鉴定。分子生物学技术可快速、敏感、特异地对ＮＴＭ进行诊断，其中包括聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术、ＰＣＲ直接测序法、ＰＣＲ限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）技术、ＰＣＲ单链构象多态性分析（ＳＳＣＰ）技术、ＰＣＲ核酸探针技术、基因芯片技术、结核分枝杆菌多位点数目可变串联重复序列（ＭＩＲＵ-ＶＮＴＲ）技术等。目前用于ＮＴＭ分类鉴定的靶基因主要包括１６ＳｒＲＮＡ、１６Ｓ～２３ＳｒＲＮＡ、ＩＳ６１１０、ｏｘｙＲ-ａｈｐＣ、ｒｐｏＢ、ｈｓｐ６５等。
１．ＰＣＲ技术 ＰＣＲ检测分枝杆菌的敏感性和特异性依赖靶基因的选择，不同目的基因的选择各有利弊，以ＩＳ６１１０为检测目的基因存在一定的假阳性问题。目前，已建立了针对不同靶基因的多重ＰＣＲ法对其进行检测。Ｇｕｐｔａ等以ｈｓｐ６５、ｄｎａＪ和ＩＳ６１１０基因为靶基因采用多重ＰＣＲ方法对收集的１６５份临床标本（包括痰、胸腹水、脑脊液、血、组织等）进行分子生物学鉴定，并同时进行细菌培养及生化鉴定。结果表明，ＰＣＲ法和细菌培养的阳性率分别为７６.３６％和５７.５７％。此多重ＰＣＲ方法提高了诊断的阳性率，可以鉴定结核分枝杆菌复合群（ＭＴＣ）和ＮＴＭ，比单一基因ＰＣＲ法具有更高的敏感性和特异性。
２．ＰＣＲ-直接测序法 ＰＣＲ-直接测序法是对特定的核苷酸靶序列进行分析，是鉴定菌种的可靠而准确的方法。Ｎｇａｎ等以１６Ｓ-２３ＳｒＲＮＡ内转录间隔区（ＩＴＳ）区为靶基因，建立多重ＰＣＲ法结合产物直接测序技术检测临床分离的ＮＴＭ。作者针对缓慢生长型ＮＴＭ（包括鸟分枝杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌、戈氏分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌）和快速生长型ＮＴＭ（包括偶发分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和龟分枝杆菌）分别设计引物，检测了临床分离的２４７株分枝杆菌，结果显示敏感性和特异性均为１００％。该方法可以实现对ＮＴＭ快速准确的鉴别。
３．ＰＣＲ-ＲＦＬＰ技术 ＰＣＲ-ＲＦＬＰ是在ＰＣＲ和ＤＮＡ序列分析基础上产生的技术，是一种常见的微生物鉴定与分型方法。用相同的限制性内切酶消化不同微生物的ＤＮＡ扩增片段后，经琼脂糖凝胶电泳可得到特征性的限制性片段谱带，通过对电泳图谱的分析可对病原体进行鉴定与分型。该法结合了ＰＣＲ快速灵敏与ＲＦＬＰ准确、特异的优点，成本低廉、结果稳定、操作简单，结合软件可分析更为复杂的ＤＮＡ电泳图谱。常用于ＰＣＲ-ＲＦＬＰ法诊断分枝杆菌的种特异性保守序列有：ＩＳ６１１０、１６ＳｒＲＮＡ基因、１６Ｓ～２３ＳｒＲＮＡＩＴＳ区、ｈｓｐ６５基因、ｒｐｏＢ 基因等。（１）ｒｐｏＢ基因序列ＰＣＲ-ＲＦＬＰ分析技术：万彦彬等以ｒｐｏＢ为靶基因设计分枝杆菌属特异性通用引物，用限制性内切酶ＭｓｐⅠ对ＰＣＲ产物进行酶切，对酶切结果进行聚类分析，建立鉴定分枝杆菌的ＰＣＲ-ＲＦＬＰ方法，具有良好的通用性和特异性。ＰＣＲ-ＲＦＬＰ法鉴定９８株分枝杆菌的结果与传统鉴定法完全一致，其灵敏度、特异度和准确度均为１００％，方法学评价指标结果达到诊断性实验的要求，为早期诊断结核病与ＮＴＭ 病提供了新的工具。Ｋｉｍ等采用双重ＰＣＲ的方法，以ｒｐｏＢ基因为靶基因设计引物，分别扩增结核分枝杆菌（ＭＴＢ）和ＮＴＭ的２３５和１３６ｂｐ的基因片段，对４４株分枝杆菌参考株和３７９株临床分离株进行检测，并进一步对１８６株ＮＴＭ选用限制性内切酶ＭｓｐⅠ、ＨａｅⅢ进行酶切鉴定和序列测定。结果表明，该方法可以准确、快速的对ＭＴＢ和ＮＴＭ进行鉴别，敏感性和特异性均为１００％，并能将ＮＴＭ鉴定至种的水平；（２）ｈｓｐ６５基因序列ＰＣＲ-ＲＦＬＰ分析技术：编码热休克蛋白的ｈｓｐ６５基因保守性较强，存在于所有分枝杆菌中，以ｈｓｐ６５基因作为ＰＣＲ扩增的靶基因结合产物直接测序可以很好的将ＮＴＭ鉴定到种，克服了因扩增产物长度不够而难以对ＮＴＭ种及亚种正确鉴定的缺陷。Ｋｉｍ等以ｈｓｐ６５基因作为靶基因，采用双重ＰＣＲ结合限制性酶切及测序分析鉴别ＭＴＢ和ＮＴＭ，并能将ＮＴＭ鉴定到种及亚种水平，具有很好的敏感性和特异性。Ｓｈｏｊａｅｉ等采用ｈｓｐ６５ＰＣＲＲＦＬＰ、１６ＳｒＲＮＡ测序结合传统细菌培养的方法对６７株临床分离的ＮＴＭ进行菌种鉴定。ＰＣＲ扩增６４４ｂｐ的ｈｓｐ６５基因序列，并用限制性内切酶ＡｖａⅡ、ＨｐｈⅠ、
ＨｐａⅡ分别进行酶切鉴定，该方法可以对ＮＴＭ的流行情况及菌种分布特点进行监测，有利于ＮＴＭ病的防控及早期诊断。
４．ＰＣＲ-ＳＳＣＰ技术 由于ＭＴＣ的１６ＳｒＤＮＡ在１２３～２７６ｂｐ完全相同，而与其他２２种分枝杆菌存在几个碱基的差异。ＳＳＣＰ技术根据不同种的ＤＮＡ单链的空间构象不同，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率也不同，从而呈现不同的谱带，达到菌种鉴定的目的。靳晓红等用ＰＣＲ-ＳＳＣＰ方法通过设计２对引物分别扩增１６ＳｒＤＮＡ２条片段，根据ＳＳＣＰ电泳图谱与结核分枝杆菌标准株的相似性鉴别结核分枝杆菌、ＮＴＢ，对９８株临床分离株进行了分析。结果表明，该方法对ＭＴＣ及ＮＴＢ的鉴别比细菌学方法快速，仅用３ｄ，且与细菌学方法具有良好的一致性。该方法可及时鉴别ＭＴＢ与ＮＴＭ，对于临床复治、难治结核病的诊断及药物选择有重要作用。
５．ＰＣＲ-核酸探针技术 ＰＣＲ-核酸探针是ＰＣＲ与ＤＮＡ探针技术相结合对分枝杆菌进行鉴定的方法，所用探针多为寡核苷酸探针，杂交方法有斑点杂交法、反向斑点杂交法以及微杂交法等。原理是利用分枝杆菌特异的基因序列，带上探针标记（如３２Ｐ同位素等），来识别与之互补的特异基因序列，从而区别ＭＴＢ与ＮＴＭ。亚能生物公司的分枝杆菌菌株鉴定基因检测试剂盒采用ＰＣＲ-反向点杂交法，根据１６ＳｒＲＮＡ序列设计出２３种菌种特异的寡核苷酸探针，与生物素标记的ＰＣＲ扩增产物进行杂交，通过膜条特定位置显色与否判断探针是否与该ＤＮＡ片段杂交，可以鉴定临床上２３种常见的致病性分枝杆菌。比利时Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ公司研制的ＩＮＮＯ-ＬｉＰＡ分枝杆菌菌种鉴定试剂盒可鉴定１６种分枝杆菌菌种。
６．基因芯片技术 基因芯片法是指将大量核酸分子以预先设计的方式固定在载体上，检测带标记的待测样品ＤＮＡ，与传统检测方法相比，具有检测时间短、通量高等优点，是一种大规模分析遗传差异的新方法。Ｐａｒｋ等基于ＩＴＳ序列建立了寡核苷酸微阵列芯片法对分枝杆菌进行菌种鉴定，采用１个属特异性探针和２０个种特异性探针进行杂交，可以对结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶然分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、戈氏分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、土地分枝杆菌、淡黄分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、母牛分枝杆菌、海鱼分枝杆菌、猿分枝杆菌、溃疡分枝杆菌等２０种分枝杆菌进行快速、准确的鉴定。作者对４６株分枝杆菌参考株、１４９株临床分离株和１５５份临床标本进行寡核苷酸芯片检测，整个检测程序（包括ＤＮＡ提取、ＰＣＲ扩增、ＤＮＡ杂交及扫描分析）在４.５ｈ内完成，结果表明该方法适用于常规实验室从临床分离株及临床标本中鉴定分枝杆菌，具有快速、准确的特点。目前商品化的分枝杆菌菌种鉴定试剂盒如博奥生物公司ＤＮＡ微阵列芯片法可以快速检测结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、戈氏分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌等１７种临床常见分枝杆菌，将常规的检测时间大大缩短，在６ｈ内即可得到结果。
７．ＭＩＲＵ-ＶＮＴＲ技术 ＭＩＲＵ-ＶＮＴＲ方法是近年发展起来的以ＰＣＲ为基础的ＤＮＡ指纹识别技术之一。ＭＩＲＵｓ与ＶＮＴＲｓ是细菌基因分型有效的标记物，以ＭＩＲＵ-ＶＮＴＲ为基础的分型方法依靠与位点侧翼区互补的寡核苷酸引物对不同位点进行ＰＣＲ扩增，由扩增产物的长度决定插入重复序列的拷贝数，而重复序列的拷贝数在菌株中各有不同。ＭＩＲＵ是一类串联重复的序列。在结核分枝杆菌中共有４１个ＭＩＲＵ位点，通过特异扩增ＶＮＴＲ／ＭＩＲＵ位点所在的序列，根据所得片段长度计算出重复单元的数目，得出数字化的谱带。ＭＩＲＵ-ＶＮＴＲ方法已经广泛用于结核分枝杆菌的基因分型和分子流行病学研究，其分辨能力随ＭＩＲＵ位点组成的不同和菌株来源而变化。Ｂｕｌｌ等将ＭＩＲＵ-ＶＮＴＲ分型方法用于ＭＡＣ的基因分型。作者已证实在鸟分枝杆菌副结核亚种（ＭＡＰ）和鸟亚种（ＭＡＡ）中存在１８个ＭＩＲＵ位点，其中６个位点的重复序列的拷贝数在ＭＡＰ和ＭＡＡ中是不同的。以４个ＭＩＲＵ位点为基础的ＰＣＲ扩增可以将ＭＡＰ分成２个基因型，将ＭＡＡ分成５个基因型。ＭＩＲＵ位点１或位点４的ＰＣＲ扩增可以鉴别ＭＡＰ和其他的ＭＡＣ，而１、４位点的ＰＣＲ扩增可以鉴别ＭＡＰ和胞内分枝杆菌。
三、展望
ＮＴＭ常可以从自然环境和室内用水中分离出来，可引起人类的慢性疾病，其感染发病率全球范围内呈逐年上升的趋势，且临床诊断和治疗比较困难，需要长期、难以耐受的治疗过程。关于ＮＴＭ感染、发病的流行病学资料目前研究的较少，且尚未建立早期、快速、敏感和特异的标准化诊断技术。ＮＴＭ肺病的临床表现、Ｘ线检查、痰抗酸染色等均与肺结核相似，常常造成临床上的错误诊断及治疗。所以ＮＴＭ的实验室诊断方面迫切需要进行更加深入的研究。现有的诊断方法各有利弊，且亟待标准化。分子生物学技术在ＮＴＭ菌种鉴定方面展现了其独特的优势及巨大的应用前景，对于ＮＴＭ的快速、准确鉴定提供了一种有效的手段，将分子生物学技术和传统的鉴定方法相结合，发挥各自的优势，是ＮＴＭ实验室诊断的一个方向。相信随着分子诊断技术的不断完善和新技术的不断涌现，必将对ＮＴＭ的早期诊断作出更大的贡献。
编辑：范伟伟
