黄朝晖1,2 综述 杜祥1 审校
1. 复旦大学附属肿瘤医院病理科，复旦大学上海医学院肿瘤学系；2. 苏州大学附属第四医院肿瘤研究所
［摘要］DNA甲基化是真核细胞基因组最常见的一种表观遗传学修饰。DNA甲基化异常在肿瘤的发生、发展过程中扮演重要角色。研究显示DNA甲基化是一类潜力很大的肿瘤标志物。肿瘤特异性的DNA甲基化标志物可从肿瘤患者血清/血浆、尿液、粪便和支气管肺泡灌洗液中检出，为进行肿瘤无创性诊断DNA甲基化检测提供了新思路。本文对DNA甲基化在恶性肿瘤早期诊断的研究进展作一综述。
［关键词］DNA甲基化；表观遗传学；循环DNA；诊断；粪便；尿
传统观点认为肿瘤的主要机制是由于致癌因素造成DNA序列变异而导致细胞生长、分化失控。近年来，随着研究的深入，人们发现DNA序列以外的调控机制异常在肿瘤的发生、发展过程中更为普遍。这种不依赖于DNA序列变化的可遗传的调控机制称为表观遗传学机制，主要包括DNA甲基化修饰、组蛋白修饰、染色体修饰、基因组印迹及microRNA调控等方式，目前对DNA甲基化的机制最清楚，研究方法亦最为成熟。DNA甲基化是真核细胞基因组最常见的一种表观遗传学修饰，也是脊椎动物DNA惟一的自然化学修饰方式，在细胞增殖、分化、发育、基因印迹等方面起重要作用，与肿瘤的发生、发展关系密切。近年来，肿瘤相关基因DNA甲基化研究取得了大量的研究成果，这些结果不仅对我们深入理解癌变的分子机制具有重要意义，并且提示DNA甲基化研究对于肿瘤的诊断、治疗也具有巨大的应用潜力。本文对DNA甲基化在恶性肿瘤无创性早期诊断的研究进展作一综述。
1 DNA甲基化与肿瘤
DNA 甲基化修饰有多种方式，被修饰位点的碱基可以是腺嘌呤的N2、6位、胞嘧啶的N2、4位、鸟嘌呤的N2、7位或胞嘧啶的C2、5 位。在哺乳动物中，DNA甲基化主要发生在二核苷酸胞嘧啶(CpG) 第5位碳原子上，即5-甲基胞嘧啶(5-mC)。人类基因组中的CpG约85％散在分布于基因组的重复序列中，其余15％主要分布于一些称之为CpG岛的区域，即CpG相对集中的特定区域。CpG岛通常位于基因的5′端启动子区，也可延伸至基因的外显子区。人类基因组中约有45 000个CpG岛，占整个基因组的1％～2％。40％～50％人类基因启动子区含有CpG岛。基因启动子区的CpG被甲基化后转录受到抑制，其甲基化的密度与转录抑制程度有关。
研究发现肿瘤细胞中存在异常的DNA甲基化状态：基因组整体甲基化水平降低，导致遗传不稳定性增加；组织特异性基因的启动子区域出现从头甲基化；癌基因多为低甲基化，导致重新开放或异常表达；抑癌基因多为过度甲基化，从而表达受抑制。大量报道显示，抑癌基因的沉默与其启动子区域CpG岛的异常甲基化直接相关，如许多细胞生长增殖相关基因与DNA损伤修复有关的基因启动子区域的异常甲基化都与其失活有关。DNA高甲基化不仅影响基因转录，还可导致C→T突变。DNA低甲基化则可导致原癌基因活化，增加染色体的不稳定性，形成突变热点。这些都会引起基因功能异常，进而导致细胞生长失控，最终形成肿瘤。
2 DNA甲基化与肿瘤无创性早期诊断
目前对癌症的诊断主要依据临床症状、直接触诊、影像学检测和组织病理学检查等，但多数癌症临床症状出现较晚，且活体取样困难，在首次诊断时已呈晚期，治疗困难，因此进行无创性早期诊断意义重大。与DNA变异相比，基因甲基化改变常是细胞癌变过程中更为早期的事件，因此可能在肿瘤早期诊断中具有更大的价值。大多数肿瘤都有多个独立的启动子甲基化事件，因此建立合理的多指标甲基化图谱能为肿瘤风险评估、早期诊断以及肿瘤预后提供有用信息。通过对各种肿瘤的CpG岛甲基化研究，人们发现CpG 岛甲基化谱具有肿瘤特异性，可作为上述肿瘤患者的早期诊断指标。这些针对肿瘤组织的DNA甲基化研究为进行肿瘤无创性诊断奠定了基础。由于实体肿瘤取材困难，体液循环DNA容易获得，因此在体液中寻找更多的肿瘤特异DNA甲基化分子标志物的研究也备受关注。
2.1 外周血循环DNA甲基化分析 正常人的外周血循环DNA来源于白细胞，而肿瘤患者的外周血循环DNA含有坏死或凋亡的肿瘤细胞、微转移灶或循环肿瘤细胞的裂解以及增值旺盛的肿瘤细胞所释放的DNA。已证实，在肿瘤患者血循环DNA中可检测到与原发肿瘤细胞相一致的DNA甲基化变化。Wong等发现73%的肝癌组织中存在p16INK4a启动子异常甲基化，而癌旁正常组织、肝炎、肝硬化患者和正常对照组均为阴性。Yeo等发现92.5％的肝癌组织存在RASSF1A启动子甲基化，其中42.5％的患者血浆DNA中也可检测到。Hu等发现31％的原发性乳腺癌患者血浆中可检出CDH1和（或）p16基因启动子甲基化；而检测血浆中APC、GSTP1、RASSF1A和RAR-beta2 4个基因的甲基化可检出62%的乳腺癌，包括33%的早期癌。最近Lofton-Day等通过基因芯片等方法从结直肠癌组织中筛选出一批候选的DNA甲基化分子标志物，并用患者血浆标本进行验证，发现TMEFF2、NGFR和SEPT9基因甲基化可能是用于结直肠癌分子诊断的新标志物。Grutzmann等也发现血浆中SEPT 9基因甲基化分析诊断结直肠癌的敏感度和特异度分别达72%和90%。一项大样本量研究显示，联合分析血清MGMT、p16、RASSF1A、DAPK和RAR-beta基因甲基化诊断肺癌的敏感度和特异度分别为49.5％和85％。Jeronimo等报道53.6％的前列腺患者血浆中可检出GSTP1基因启动子高甲基化。通过对8个基因(CDH1、APC、MGMT、RASSF1A、GSTP1、p16、RAR-beta2和ARF)的甲基化分析，Hoque等发现67％的肾癌患者血清中可检出异常甲基化标志物。最近一项针对多种实体瘤患者的血浆DNA甲基化分析也证实了该技术在肿瘤无创性诊断中的潜在价值。这些研究表明，利用血循环DNA甲基化分析进行恶性肿瘤分子诊断具有广泛的应用前景。
2.2 粪便DNA甲基化分析 由于大肠癌组织持续脱落细胞到粪便中，且能在其中稳定存在，因此检测粪便中大肠癌相关基因的甲基化状态有可能成为一条结直肠癌无创早期诊断的新途径。2004年，Muller等首次报道可从大肠癌患者粪便中检测到基因异常甲基化，发现粪便SFRP2基因甲基化分析可检出90％(9/10)或77％(10/13)的大肠癌，特异度为77％(10/13)。同年发表的另外两篇文献进一步证实粪便DNA甲基化检测用于大肠癌诊断是可行的。Lenhard等报道粪便HIC1基因甲基化分析诊断大肠癌的敏感度和特异度分别为42％和98％。Chen等首次发现Vimentin基因甲基化可能是一种新的肿瘤标志物，粪便Vimentin基因甲基化分析诊断大肠癌的敏感度和特异度分别为46％和90％。Zhang等检测了36例大肠肿瘤和17例正常对照粪便中SFRP1基因的甲基化状态，发现其诊断特异度和敏感度分别为89％和86％。Leung等［19］发现检测粪便中7个基因(APC、ATM、hMLH1、SFRP2、 HLTF、MGMT和GSTP1)的甲基化诊断大肠癌和腺瘤的敏感度分别为75％和68％，特异度为90％。国内相关研究很少，我们分析了52例大肠癌患者、35例大肠良性疾病患者和24名正常对照者粪便DNA中SFRP2、HPP1和MGMT基因启动子的甲基化状态，结果显示联合3个基因诊断大肠癌和癌前病变的敏感度和特异度分别为93.7％和77.1％。
2 .3 尿沉渣DNA甲基化分析 尿沉渣分析则为泌尿系统肿瘤的无创诊断提供了可能。Hoque等应用荧光实时PCR技术分析了膀胱癌患者尿沉渣中9个基因的甲基化状态，筛选出4个基因(CDKN2A、ARF、MGMT和GSTP1)对膀胱癌具有诊断价值，其诊断敏感度和特异度分别为82％和96％。另一项针对20个基因甲基化检测的研究显示，利用尿沉渣DNA甲基化分析可检出91.4％（95/105）的膀胱癌。上海市肿瘤研究所的最近一项研究则显示，以筛选的11个目的基因为靶点进行尿沉渣DNA甲基化分析，可检出91.7％（121/132）的膀胱癌患者。Negraes等也发现RARB 和RASSF1A基因的DNA甲基化分析可预测膀胱癌的术后复发。Hoque等通过对8个基因(CDH1、APC、MGMT、RASSF1A、GSTP1、p16、RAR-beta2和ARF)的甲基化分析，发现88％的肾癌患者尿中可检出异常甲基化标志物。多项研究研究则显示尿GSTP1甲基化分析对于前列腺癌早期诊断具有重要价值。此外，最近研究还证实尿沉渣DNA甲基化分析可能对于宫颈癌的诊断也具有一定的价值。
2 .4 支气管肺泡灌洗液DNA甲基化分析 Ahrendt等首次报道了支气管肺泡灌洗液DNA甲基化分析对肺癌的诊断价值，发现19例p16基因高甲基化肺癌患者中，有16例患者的肺泡灌洗液中可检出相应的p16异常甲基化。而Topaloglu等通过对31例肺癌患者肺泡灌洗液中8个基因(CDH1、APC、MGMT、RASSF1A、GSTP1、p16、RAR-beta2和ARF)的甲基化分析，发现可检出6 8％的肺癌患者。Belinsky等的研究也显示支气管肺泡灌洗液DNA甲基化分析用于肺癌诊断具有比血清更高的敏感度。
3 问题与展望
鉴于DNA甲基化状态作为分子标志物有着众多的优点，并可很有效地反映相关基因的转录状态，这使其成为对体液中微量DNA进行甲基化分析诊断肿瘤的最有希望的分析标志物之一。利用高效的DNA甲基化检测技术，检测血浆/清、尿液以及粪便等材料中肿瘤特异的DNA甲基化标志物具有方便、快捷、特异和无创的优点，不受肿瘤组织取材不便的限制，且可检出影像学检查为阴性的肿瘤，对于肿瘤的早期诊断、预后监测及跟踪随访均具积极意义。然而将其应用于大规模的临床还有待于认真评估这些样本中DNA甲基化标志物的检测结果与大样本的、随机的、前瞻性的临床资料间的吻合程度。同时也需要进一步筛选兼具高敏感性及特异性的DNA甲基化标志物组合，即建立各肿瘤特异性的DNA甲基化高效率诊断谱式。此外，建立易于临床推广的标准化的DNA甲基化检测技术也是需要解决的关键问题。相信随着表观遗传组学计划（epigenome project）（http://www.epigenome.org； http://www.epigenome-noe.net )的实施，正常组织和肿瘤组织基因组DNA甲基化图谱的建立，将会进一步揭示肿瘤发生机制，从而更好地推动DNA甲基化标志物应用于临床。
编辑：范伟伟
