天津医科大学总医院天津市肺癌研究所、天津市肺癌转移与肿瘤微环境重点实验室 吴志浩，周清华
肺癌已成为世界范围内最主要的肿瘤死亡原因，大约31%与癌症相关的死亡是由肺癌造成的。在世界范围内，肺癌患者的5 年存活率也只有大约15%。目前肺癌低存活率主要在于基于症状的诊断方法对发现早期肺癌并不十分有效，3/4 的病人在确诊时肺癌已发生转移。若能在早期检测到肺癌病变，病人5年存活率可提高到60~80%。第十二届肺癌大会已圆满结束，来自不同国家的科学家呈现了许多早期诊断的工作和研究。因为通过对肺癌早期分子的检测，可以筛选出肺癌的高危人群，并可根据所检测到的基因变异进行选择性病变切除或药物干预等早期治疗。近年来已有利用计算机X 线体层摄影（CT扫描）成功检测早期肺癌的报道, 但临床应用这一技术还存在一些问题。由于存在大量非特异性的良性结节（benign pulmonary nodules），CT诊断的特异性并不是很高。其次，CT扫描的费用极高，而且必须多次使用来鉴定肿瘤生长速度，这就不可避免的将病人反复暴露在有害的放射线中。最后，这一技术还不能确定哪些早期病变会始终处于休眠的良性状态，哪些可能会恶性癌变，需尽早治疗遥改进的支气管镜检如利用带有荧光的支气管镜或许增加对小的、细微的肺部癌变的敏感度。但所有这些方法都不太可能用来作为大规模筛选和检查手段。因此，研究和开发肺癌分子标记显得尤为重要。
肺癌的发生，象其它肿瘤一样，是通过连续的基因变异或基因表位变化的一个多步骤过程，这个过程可能需要较长时间的积累。有证据表明，由长期吸烟而造成的分子水平上的变化可以持续很多年，这个时间段就为早期诊断提供了一个极好的机会，因而这些变异就可以用于肺癌早期的诊断和对高危人群的筛选。
肺癌的分子标记可以归为三类：一是血清分子标记；二是组织分子标记；三是痰液分子标记。肺癌早期诊断不太容易的一个主要原因是难以获取病变组织。因此目前临床上一般首先通过影像学初步诊断，最后经组织病理学证实。痰细胞学检查是最常见的而且非创性的肺癌诊断方法。因为痰液直接来源于气管，肺癌细胞或肺癌病变前细胞甚至改变的蛋白变化都可出现在痰液中，因此痰细胞学检查有可能在影像学发现病变之前诊断出早期肺癌。但是痰细胞学检查的敏感度不是很高，尤其对周围性肺癌遥血清中的分子标记并不局限于原发肿瘤在肺部所处的位置，而且较易收取，成为最有吸引力的肺癌分子标记。
肺癌基本上分为两大类：小细胞肺癌和非小细胞肺癌。非小细胞肺癌又可进一步分为腺癌、大细胞癌和鳞癌。虽然80%以上的肺癌属于非小细胞肺癌，但小细胞肺癌具有神经内分泌细胞的一些特性。因此，利用血清中的分子标记在诊断小细胞肺癌比大细胞肺癌相对有利。但目前临床所用的分子标记只能描述为与肺癌相关，而非肺癌特异，而且敏感度较低，难以用于早期诊断。临床应用中常常将不同分子标记联合使用，例如神经元特异烯醇酶（NSE）和细胞角蛋白的分子标记CCYFRA21-1。NSE 来源于中心和边缘神经元以及神经外胚层衍生的肿瘤。在小细胞肺癌和一些炎症性呼吸道疾病的细胞表达量大大增高，NSE 和CCYFRA21-1联用可大大提高诊断小细胞肺癌的敏感度。
随着高通量分子生物学技术的迅猛发展和对肺癌生物学日益增加的了解，寻找和发现肺癌早期诊断的分子标记已有大量报道。尽管如此，迄今为止还没有发现一个即具有高敏感性、又有高特异性，并且重复性好的肺癌早期诊断分子标记。由于这次肺癌大会呈现的内容十分丰富，覆盖面极广，本文只对具有前景的血清中生物标记近几年来的进展以及大会报道的最新发展作一介绍。
1 早期诊断分子标记
1.1 血液循环中的DNA 一般来说，肺癌患者的血清或血浆中DNA的含量比正常人要高。这些无细胞DNA主要来源于凋亡或坏死的肿瘤细胞。但由于所使用测量DNA的方法不同，不同实验室所发表的肺癌患者血液循环中DNA 的浓度变异很大，而且循环DNA浓度与肿瘤的体积、阶段、以及预后判断没有多大相关性。因此，检测循环DNA的浓度本身不可能作为肺癌早期诊断的分子标记。但是若能在循环DNA中检测到与肺癌相关的遗传或表观遗传的变化，这些特异的变异就可用于未来的肺癌分子标记。从诊断角度来看，任何分子水平的异常，无论是导致癌变的直接原因或间接原因，只要具备肿瘤特异性，都可以作为肿瘤分子标化。An等从73例肺癌患者的肿瘤细胞中发现88%有p16 甲基化，在这些病人的血浆中同样检测出这些变异。
基因组不稳定性是肿瘤的一个主要特征，正是因为基因组不稳定而使基因突变的几率大大提高并得以积累，从而导致肿瘤的发生。杂合性丢失（LOH）和微卫星不稳定性（MSI）表明了基因组的不稳定性。因此，所以很多实验室力争从循环DNA 中检测到微卫星不稳定（MSI）和杂合性丢失(LOH)。从总体上，遗传变异（MSI 和LOH）可以从22%-88%肺癌患者的循环DNA中检测到。若肺癌组织标本的检测结果是LOH或MSI阳性，从患者的循环DNA中检测到这些变化的概率可能更高、可达（48%-94%）。LOH也可用于早期诊断，Allan 等检测到13 个带有肺癌可疑症状的患者循环DNA中的LOH，其中12 个患者随后诊断为肺癌，并且循环DNA 中的LOH 和相对应组织活检的LOH 完全一致。
血液中循环DNA并不都是来源于肿瘤细胞，正常白血球的裂解也可导致循环DNA浓度增高。因此，直接比较循环中DNA和来自同一样本的白血球DNA来检测MSI 和LOH，会使这一检测方法更加准确，成功率更高。
染色体3p 的缺失是肺癌发生过程中检测到的最早也是最常见的分子变异，因此应该包括在所有的筛选以及检测方法中。染色体3p 缺失可在90%SCLC和80%NSCLC中发现。脆性组氨酸三联体基因（FHIT）是位于3p14.2 脆性位点的抑癌基因，并且可能是烟草致癌作用的分子靶点。失去FHIT基因表达是肺癌发生过程中较早的分子变化，并且和不良预后成正相关。目前对FHIT基因功能的研究很多，主要集中在其促凋亡的作用上。有报道，FHIT修饰Akt-Survinin 信号传导途径，但FHIT 极有可能参与了ATR-Chk1 的DNA损伤应激反应途径。最近一期的PNAS报道了FHIT介入Wnt-β-catenin 途径，并抑制β-catenin 的转录活性。因为染色体3p 缺失是支气管癌变的早期事件，通过分析FHIT基因的微卫星变异情况，80%吸烟的肺癌患者中有FHIT基因的杂合性丢失。因此，利用3p 区域的微卫星标记筛选高危人群和进行肺癌的早期诊断，可能很有前景。
K-ras 突变可以从30%的非小细胞肺癌患者中检测到，特别是密码子从G 到T 的颠换只发现在由吸烟引起的腺癌中。有条件在小鼠中表达突变的K-ras可在肺部形成腺瘤，这些都表明K-ras 在腺癌的发生以及早期发展可能起着重要作用。肿瘤抑制基因p53 编码一个核蛋白，其功能涉及到细胞周期的调控、DNA 修复、基因组的稳定性以及细胞凋亡等诸多方面。p53 的突变可以在50%以上非小细胞肺癌和70%的小细胞肺癌中检测到。直接利用qPCR方法也可以从循环DNA 检测到与肺癌直接相关的K-Ras 和p53的突变。
DNA 甲基化在调节基因表达以及生物体的生长发育方面起着关键作用。在肿瘤细胞内，整个基因组往往呈低甲基化，而某些个别启动子区域表现超甲基化。在肺癌早期阶段，几个重要的抑癌基因如p16、FHIT和APC 的启动子超甲基化都可检测到。Esteller 等从22 个非小细胞肺癌患者的血液中分析四个基因启动子甲基化（p16INK4A、DAPK、GSTP1 和MGMT），整体阳性率可达到50%。在这次大会中不同实验室都报道了他们对p16、DAPK 以及RASSF1A 甲基化的研究，特别是位于3p21.3 的RASSF1A (Ras association domain family 1A)抑癌基因，其甲基化与肺癌的不良预后有很大关系。
1.2 血液循环中的RNA 肿瘤中很多基因的表达异常可导致肿瘤细胞生长和增殖失控，这些表达异常的蛋白或mRNA在理论上都可作为肿瘤的分子标记。尽管肿瘤患者血液中RNA酶浓度比正常人高，但还是可以从肿瘤患者血液中检测到肿瘤来源的RNA。Sueoka等利用q-PCR发现46%的肺癌患者血液中RNA结合蛋白hnRNP B1 水平升高。Miara 等利用real-time PCR 方法检测肺癌和正常人端粒酶催化亚单位（hTERT）和EGFR 的mRNA，结果显示血清中的hTERT mRNA 拷贝数与肺癌的分期、转移以及复发都呈正相关。来自西班牙实验室报道了在非小细胞肺癌患者的血清中端粒酶的催化亚单位hTERT 的RNA明显增高，并与不良预后呈正相关。有趣的是他们同样报道了患者血清中的K-Ras 的突变和临床所诊断的各种特性无关。
虽然利用血液循环中DNA 或RNA 作为一种简单、非创伤性肺癌诊断方法已有大量报道，但应用于临床之前还有很多工作要做。目前检测循环DNA的方法敏感度还不够，即使两个或多个分子标记组合，所获得阳性率也只有40~80%。而且，技术方面也需要进一步改进，包括从血液中抽提高质量的DNA、RNA以及改进定性定量的测量方法以增加其敏感度和特异性。
1.3 血清中蛋白分子标记 肿瘤不仅是遗传水平的紊乱造成的，更是蛋白水平上的综合疾病。细胞内估计的蛋白数量远远多于编码的基因，加上转录后各种不同的修饰，例如蛋白磷酸化、糖基化在肿瘤细胞的信号传导以及生长增殖中都起着重要作用。因此，寻找蛋白分子标记是当前肿瘤研究的热点之一。近年来利用新型的蛋白组学技术寻找肺癌的分子标记已有大量报道。然而，利用蛋白质组学从血清或血浆中寻找肺癌的分子标记具有很大的挑战性。首先是血清蛋白成份的多样性和复杂性，其次是蛋白浓度的巨大差异。Howard等采用MALDI-TOF-MS方法鉴定出两个与肺癌相关的蛋白，一个是血清中amyloid A和噬菌体移动抑制因子(macrophage migratory inhibitory factor)。在随访研究中用Elisa 方法证实了肺癌患者的血清amyloid A的浓度确实增高，但噬菌体移动抑制因子对肺癌并不显示很高的特异性。
2007 年美国时代周刊将万能医药公司（Panacea Pharmaceuticals）的肺癌诊断试剂LC Detect(SM)列为全年十大医学新突破之一。LC Detect 测量血液中HAAH(asparaginyl beta-hydroxylase)的浓度。HAAH是包括肺癌在内的许多不同肿瘤的分子标记，敏感度和特异性都比较好。99%肺癌患者（包括早期肺癌患者）都可从血清中检测到增高的HAAH 浓度，而在正常人血清中几乎检测不到HAAH。
实体瘤一般分泌不同生长因子来促进肿瘤繁殖和转移或诱导新生血管的形成，象干细胞因子（SCF）、肝细胞生长因子（HGF）和内皮生长因子（VEGF）。在不同肺癌患者的血清都发现这些生长因子有不同程度的升高，但目前对这些潜在的生物标记是否可以用来作为早期诊断或是用来预后判断或监测复发还没有达成共识。
Carlos. C等人在这次肺癌大会上报道了非小细胞肺癌患者血清中VEGF 的浓度比正常人显著性升高，但bFGF和NGF并没有显著性差异，而且VEGF 浓度与肺癌的阶段，对治疗反映以及转移都没有关系。
1.4 其它有潜力的分子标记 已经发现包括肺癌在内的许多肿瘤中存在线粒体DNA的突变。Jeronimo 等从前列腺病人的血清中检测到突变的线粒体DNA。线粒体DNA也有可能用作未来检测肺癌的分子标记。肿瘤细胞内突变的或过量表达的蛋白有可能作用于自身免疫系统而产生自身抗体。具有p53突变的肺癌患者的血清中可以检测到抗p53 的抗体。Gao 等将已知的肿瘤相关抗原的抗体点到芯片上，然后用此芯片与病人的血清温育而分离循环中的肿瘤相关抗原。他们发现肺癌患者存在特殊的血清蛋白谱。
2 分子分期和肺癌个性化治疗
对肺癌的分期，目前临床上还是使用TNM系统。这种基于解剖学的TNM 分期对确定病变范围、临床试验中患者的分组、治疗方案的选择以及对疾病的预后估计和准确报告，具有重要的临床意义。尤其当患者只需局域性治疗，如手术切除或局域化疗，TNM 分期非常有用。对于预后判断，TNM分期系统提供较为单一的参数，I 期肯定比II 期好，II 期肯定比III 期好。然而，由于肺癌的多样性和复杂性，许多肺癌患者疾病的发展和预后结果与诊断的分期极不相符，尤其当需要选择治疗方案，如佐剂的化疗以及生存期判断，TNM系统有着公认的缺陷。利用分子标记物，可能将形态学极为类似的肿瘤分成亚组，而这些亚组在临床上的表现极为不同。另一方面，许多靶向治疗药物也只有在它们相对应的基因发生突变或过量表达时才具有效果。
最有说服力的证据是表皮生长因子受体（EGFR）的抑制剂。EGFR 是一种酪氨酸激酶，其基因组DNA长200kb，由28 个外显子所组成。酪氨酸激酶的功能区由外显子18~24 所编码。靶向药物吉非提尼（gefitinib）和埃罗提尼（erlotinib）正是结合到此激酶的功能区。EGFR 的基因变异主要发现在具有腺癌组织学特征的非吸烟患者，并且女性居多。早期利用免疫组化
所检测到EGFR的过量表达的患者对EGFR抑制剂并不产生反应，预后判断也不佳。最终Lynch和Paez 实验室同时发现一些EGFR的突变体，这些突变体都局限在外显子18 到21，最常见的是在外显子19 上的in-frame 缺失（45%），其次是在外显子21 中的点突变而造成亮氨酸到精氨酸的转变（L858R，41%）。将此突变体转染到体外培养的细胞中，转染的细胞表现出增强的EGFR的酪氨酸激酶活性，并且此酪氨酸激酶的活性对吉非提尼表现敏感。在临床上，对带有这些突变体的肿瘤患者使用吉非提尼及埃罗提尼后，症状的改善以及整体生存率都有极大提高。但问题并不这么简单，有的病人在吉菲提尼用药一段时间后，病情还有发展。在这次大会上很多实验室报道了EGF受体的另外一个突变(T790M)以及MET 的基因扩增可导致对酪氨酸激酶抑制剂吉非提尼和埃罗提尼的抗性。
最近两年，在铂类辅助化疗非小细胞肺癌的的预后判断也取得较大进展。铂类化合物结合到DNA 后，和DNA产生铂类原DNA 加合物（adducts），从而抑制肿瘤细胞的DNA复制。但体内存在许多不同的DNA修复机制，这些DNA修复机制极有可能和铂类药物的抗性有关。Qlaussen 等证明了DNA修复过程中一个重要限速蛋白ERCC1 (Excision repair cross-complementation group 1)与铂类药物的抗性呈正相关。患者在ERCC1 蛋白缺失或表达量较低的情况下，接收铂类辅助化疗比ERCC1呈阳性患者的生存率大大提高。这次大会上很多实验室也都证实了ERCC1 和非小细胞肺癌预后有关遥另一个类似进展是核苷酸还原酶RAM1(ribonucleotide reductase M1) 的表达，可能用于铂类/Gemcitabine 治疗非小细胞肺癌的预后判断，但还需要更多的样本加以证实。
Ras 蛋白必须共价结合法尼基(farnesyl group)基团，才能结合到膜上发挥其生物学功能。因此，抑制法尼基化对携带K-ras 突变的患者是一个靶向治疗的选择。但临床上法尼基转移酶抑制剂的治疗效果并不理想，可能是K-ras 可以被另外不同的酶所修饰[43]。有趣的是，K-Ras 突变和EGFR 突变几乎是互相排斥的。K-Ras突变的患者一般预后不良，并对埃罗提尼和吉非提尼的治疗有抗性。
这也反映了肿瘤分子水平上的复杂性和多样性。对研究这种广范围的分子变化以及它们之间相互作用传统的一对一基因研究方法显得能力不足。近年来迅猛发展的高通量技术为研究象肺癌这种极其复杂和多样的肿瘤提供了一个很好的平台。虽然这一研究领域还不是太成熟，由此而产生的分子图谱甚至超出我们现有对肿瘤的了解遥但这些三维分子数据无疑为肺癌的分子分期，个性化治疗以及对肺癌的了解无疑起到巨大的推动作用。
肿瘤的生物学（包括形态学）与肿瘤细胞内基因的表达息息相关。如果肿瘤的某些生化特性或者某个信号传导途径控制和调节特定肿瘤的恶性生长及转移，这些特性及与此相关的基因表达图谱从理论上就可以作为此肿瘤的分期以及预后判断的指标。近年来利用芯片技术针对肺癌的分子分期和预后产生了许多意想不到的结果。
Tomida 等利用非监督类聚法对8644 单一基因进行分析，可将非小细胞鳞癌分成两个不同亚群。两个亚群具有不同的组织学特征。更重要的是，对患者的预后判断，这两个亚群存在着重大区别，预后不佳的一组明显高表达胞外间质蛋白，例如fibronectin, SPARC 和不同胶质蛋白的亚聚体alpha2(I)和alpha1(III)。
但对于肺癌来说，利用芯片技术进行分子分期以及以此为基础的预后判断方面的进展并不象对乳腺癌研究那么令人鼓舞。主要原因是由不同实验室所产生的分期的基因表达图谱变异很大，无法得出与临床相关的肯定的结论。例如，腺癌究竟有几个不同亚群，并没有达到一致的共识。不同实验室报道从2 到6个不等腺癌群体，而且不同类型从临床行为、形态特征以及基因表达图谱都不完全一致。很难从这些数据中找出令人信服和无可争议的腺癌亚群体。最近Meyerson 实验室将来自斯坦福大学(Standford University)、密西根大学(University of Michigan)和丹纳-法博癌症研究所（Dana-Farber Cancer institute,Boston. MA）231个不同芯片数据进行统一再分析，将腺癌明显分成三个亚型：Bronchoid、Squamoid 和Magnoid。Bronchoid腺癌多发生在非吸烟女性，并常携带EGFR基因的突变，处于早期的这一类型，有相当高的生存率，但若诊断为晚期，生存率相当不好。相反，Squamoid腺癌较易出现在吸烟男性并伴有K-Ras 突变的群体。早期诊断的Squamoid 腺癌的临床行为并不如Bronchoid 类好。但晚期生存率比Bronchoid 类要高，这些分子分期无疑为个性化治疗提供了极好模式。
3 问题与展望
毫无疑问，由于基因组学及蛋白组学的巨大推动，肿瘤分子分期取得了巨大进展。但是，在实际的临床应用方面，许多问题还需回答和解决。分子分期究竟和传统的TNM分期系统关系究竟如何？分子分期是独立于TNM系统以外的另一类分期方法，还是需要将分子分期整合到TNM系统中。另外，临床上使用芯片技术还是相当有限，不仅仅是成本问题，芯片的重复性和独立验证都存在着问题，而且基因表达谱也会根据不同芯片种类的选择和分析方法的不同而有很大区别。尽管如此，随着生物技术的巨大发展，我们相信肺癌的分子诊断和分子分期将会有一个质的飞跃。另一方面，发展简便的非创性的肺癌分子标记的检测对肺癌的早期诊断和肺癌的治疗起着关键作用。早期诊断是降低肺癌死亡率的关键因素，通过对肺癌早期分子的检测，可以筛选出肺癌的高危人群，并可根据所检测到的基因变异进行选择性病变切除或药物干预等早期治疗。之所以时代周刊将LC Detect 列为全年十大医学突破之一，是因为简便可行的肺癌早期诊断成为可能，而且通过对遗传及功能的分子标记的检测，为肺癌患者的个性化治疗提供了依据。
编辑：范伟伟
