北京大学第一医院血液研究室 朱平
近年临床研究表明，大部分白血病和淋巴瘤存在某种染色体易位，易位会产生新的融合基因。这些标志可以用于诊断不同类型的白血病和淋巴瘤。世界卫生组织2000年发布的白血病和淋巴瘤诊断标准已经将染色体易位作为最重要的指标之一。当前白血病和淋巴瘤的治疗取得了很大进展，不幸的是，相当一部分患者最终会复发，复发的原因是许多完全缓解的患者体内仍然存在常规方法不能检测出来的低水平的肿瘤细胞，称为微小残留病(minimal residual disease，MRD) 。目前，临床治疗的目标是使患者达到分子水平上的缓解，这就要求MRD检测的灵敏度能够达到1/10细胞，能够定量，快速、价廉、易于标准化，同时能在不同实验室重复结果。
一、白血病和淋巴瘤分子诊断策略
在分子水平诊断白血病和淋巴瘤主要针对特定的染色体易位和易位形成的融合基因，其方法主要包括荧光原位杂交技术(FISH)，PCR，RT-PCR，实时定量PCR。FISH 适用于多种临床标本，包括血液、骨髓、组织印片、体液，甚至石蜡包埋的组织标本。由于FISH 对处于分裂中期和间期细胞都能检测，克服了常规的细胞遗传学诊断淋巴瘤和白血病必须细胞处于分裂中期的障碍。FISH利用DNA链可以和其互补链结合(杂交)的原理，杂交分子探针用荧光素、生物素或者地高辛标记，检测附着在显微镜玻片上的分裂中期或间期细胞的核DNA。FISH的灵敏度不及PCR，主要用于初诊和复发的检测。PCR是检测融合基因确定染色体易位的首选方法。尽管不同类型的白血病和淋巴瘤存在多种染色体易位，可以用多重PCR(multiplexed)在多个试管同时检测多种(通常包括82种)融合基因，国内外一些单位都已经作为诊断常规。常规的细胞遗传学方法是在全基因组水平筛查染色体易位的传统方法，但是标准的核型分析和显带技术容易漏检许多染色体的微小异常。染色体核型的波谱分析(spectral karytyping，SKY) 和比较基因组杂交技术(comparative genomic hybridization，CGH) 是以分子杂交检测为基础利用荧光染料检测全基因组染色体异常的新技术。SKY是用代表全部24条染色体的、不同染料标记的探针同时杂交，用Fourier光谱仪分析光谱重叠，然后用特殊的图像分析软件分析结果。SKY可确定以前许多难以明确的染色体易位和重排。比较基因组杂交技术是用不同标记的肿瘤细胞DNA和正常细胞的DNA同时进行杂交，得知肿瘤基因组中DNA拷贝数变化。这些方法尚未成为临床应用的常规检查。
二、白血病和淋巴瘤微小残留病的检测
巢式PCR和荧光实时定量PCR都能敏感地检测白血病和淋巴瘤微小残留病MRD，主要是检测其融合基因。淋巴系肿瘤如果没有特异性融合基因，还可以检测T细胞受体或者免疫球蛋白的基因重排。巢式PCR能够检测出106个正常细胞中的一个癌细胞。荧光实时定量PCR在一个密闭系统进行，不需要常规PCR的后续操作过程，减少了PCR污染的机会，因此比常规PCR法更优越。它应用荧光探针可以结合在PCR产物上的原理，通过检测荧光信号强度进行定量。
1．急性早幼粒细胞白血病(APL)：近年的全反式维甲酸与砷剂治疗APL使许多患者容易达到缓解，但由于形态学检查难以发现MRD，复发一直是最大的临床难题。一般认为白血病细胞108以下时依赖自身免疫机制就可控制，超过109-10可能导致复发。多数APL有染色体t(15；17)易位，位于15q22和17q21的早幼粒细胞白血病(PML)基因和维甲酸受体a(RARa)基因融合成PML/RARa。PCR检测PML/RARa就可诊断微小残留病。APL中常见两种融合基因：PML第6外显子和RARa第3外显子结合形成p6r3(L型，约占55%)；PML第3外显子和RARa第3外显子结合形成p3r3(S型，约占45%)。少数APL患者还存在t(11；17)形成的PLZF/RARa融合基因，这些都可以用PCR法检测。
2．慢性粒细胞性白血病(CML)：新药格列维(imatinib)治疗能使大多数新诊断的CML达到细胞遗传学完全缓解(CCR)。CCR患者可以使用实时定量PCR来检测是否存在MRD。CML的外周血和骨髓细胞都可以用于监测t(9；22)形成的BCR/ABL融合基因。实时定量PCR在扩增靶DNA过程中就进行检测。可以鉴定残留的BCR/ABL阳性细胞数量的变化趋势，这些实验已经在国内外很多实验室进行了。
3．有AML1-ETO融合基因的急性粒细胞白血病(AML)：t(8；21)是AML中最常见的染色体异常 。位于21q22的AML1基因与8q22的ETO基因融合，产生AML1-ETO。最近发现在长期缓解的患者体内或者新生儿血中偶然可以检测到AML1-ETO 对其是否能作为MRD的代表提出一些疑问。大约20%~40%AML-M2患者有t(8；21)，年龄越小发生率越高。AML-M2b患者t(8；21)占90%。一项利用两种RT-PCR方法进行的研究共取了51个患者223次骨髓标本，每一标本至少在两个实验室检测。发现所有长期缓解的t(8；21)AML患者PCR都阴性；在巩固治疗之前用一步法PCR检测结果阴性者预后较好。
4．滤泡性淋巴瘤(FL)：近期采用的体外清除骨髓B细胞的自体骨髓移植、单克隆抗体和肿瘤疫苗治疗改善了滤泡淋巴瘤的预后。用PCR连续监测达完全缓解的FL患者骨髓中的MRD发现，部分患者确实获得了分子水平的缓解。没有达到或维持分子缓解的患者往往复发。由于80%~90%的FL患者都存在t(14；18)易位，IgH/BCL2是一个很好的分子标记。已经发现用骨髓检测FL的MRD比外周血的灵敏度高。
5．急性淋巴细胞白血病(ALL)：检测B-ALL MRD的主要分子标志是患者有特异性的IgH基因重排，每个淋巴细胞克隆的IgH基因序列的长度各不相同。可用PCR扩增IgH基因，观察是否有单克隆基因重排来作出诊断。没有发现染色体易位的淋巴系肿瘤都可以用这种技术检测MRD。实时定量PCR由于实际操作困难。尚未广泛地应用。
三、基因芯片做白血病和淋巴瘤基因表达谱分析
迄今白血病和淋巴瘤是依靠形态学、免疫表型、遗传学特征、临床表现和可能起源某种正常细胞分型。随着人类基因组测序的完成，借助DNA芯片技术，现在有可能得到不同类型肿瘤的转录基因表达谱(gene expression profiling，GEP)。GEP研究最常用的平台是cDNA或寡核苷酸芯片技术。cDNA芯片是将cDNA克隆的PCR扩增产物点在滤膜或玻片上。cDNA芯片的一个优点是可以有针对性地设计排列的基因，以解决某一具体问题，例如，最近报道了一种称为“淋巴芯片”(lymphochip)的cDNA芯片，就是在芯片上集中了对淋巴细胞有生物学意义的数千种基因 。弥散大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是第一个通过GEP获得的信息进一步分类的肿瘤，已经发现DLBCL存在两种对化疗反应不一的类型 。寡核苷酸芯片是在硅片上原位合成或者点上许多寡核苷酸探针，建立所有肿瘤通用的寡核苷酸芯片平台可以使不同类型肿瘤的数据之间的比较变得简单、方便。应用基因芯片技术进行白血病和淋巴瘤GEP研究已发表了许多论文。但是迄今为止，用于临床诊断的基因芯片尚未问世。不过，诊断弥散性大B细胞淋巴瘤的芯片有望最先被应用到临床。笔者不久前所做的PCR基因芯片是将数百种融合基因的引物置于有大量反应室的芯片内。同时进行实时定量PCR，以鉴定白血病患者存在何种融合基因。当然，GEP一些结果已经开始从另一途径影响临床检测，典型的例子检测慢性淋巴细胞白血病(CLL)/tb淋巴细胞淋巴瘤(SLL)中ZAP-70的表达 。研究CLL/SLL的GEP发现，白血病免疫球蛋白重链可变区(IgHv)发生体细胞突变和不发生突变者有显著不同。不发生IgHv突变者预后不良，而有IgHv突变者病情进展则缓慢得多。检测IgHv突变步骤复杂，临床不易实施。幸运的是，ZAP-70是否高表达是突变最好的代表，高表达预示 Hv基因未发生突变。用流式细胞仪或者免疫组化染色检测ZAP-70蛋白可以直接用于临床。需要指出的是。从公共网络系统获得的数据并非总能得到相同的结论，肿瘤标本取样不同、不同芯片的差异和缺陷、数据分析方法的差异、芯片检测的系统误差等都使GEP容易出错。GEP另一个问题是容易漏掉肿瘤标本中低水平表达而与肿瘤更相关的基因。应用显微切割法辅以RNA的扩增。有望解决这个问题。
四、蛋白质芯片用于白血病和淋巴瘤
细胞功能活动的最终执行者是蛋白质。虽然蛋白质是由基因组编码的，但是在基因组可能编码的所有蛋白质中，机体仅合成其中的一小部分。对基因组产生的所有蛋白质的研究称为“蛋白质组学”(proteomics)，而所有被研究的蛋白质统称为“蛋白质组”(proteome)。事实上蛋白质技术早已用于白血病和淋巴瘤的日常诊断和治疗中 。例如BCL-2蛋白是一种抗凋亡蛋白，在t(14；18)易位的滤泡淋巴瘤表达水平会升高。免疫组化检测BCL-2蛋白已经用于B细胞淋巴瘤的诊断和预后判断，弥漫性大B细胞淋巴瘤如果检测到BCL-2的表达就表明预后不良。所以借助单个蛋白质就可辅助诊断、判断预后。但是，要逐一分析白血病和淋巴瘤细胞众多的致病相关蛋白质是个耗时耗力的工作，往往分析了很多蛋白仍然错过了关键的变化。最近蛋白质组学的研究技术发展很快，已经能够像绘制基因指纹图谱一样绘制蛋白质指纹图谱，被称为蛋白质芯片。基因芯片需要将所有的靶序列都点到载体上，必须了解点样了什么序列。蛋白质图谱分析与之不同，不需要对有关的蛋白质逐个进行分离和鉴定。蛋白质芯片基于质谱技术，尤其是表面增强的激光解析电离-飞行时间技术(surface-enhanced laser desorption ionization time-of-flight，SELDI-TOF)。用SELDI-TOF分析时，先把从患者标本(血清、尿液、组织裂解液)结合到芯片上，洗去未结合的蛋白质和其他杂质，然后用激光使蛋白质解析，作为带电荷离子发射出去，检测它们的飞行时间。可以计算质荷比(mass-to-charge ratios，m／z)，用生物信息学软件来分析结果。SELDI-TOF成功地确定了患有卵巢癌和未患卵巢癌妇女的血清蛋白质组图谱特征，可以检测出几乎全部卵巢癌病例。蛋白质芯片有望应用到临床诊断，包括治疗后微小残留病的监测，高危人群(如移植患者)中肿瘤的筛查，肿瘤从低度恶性向高度恶性演变的监测等。激光捕获显微切割(laser capture microdissection，LCM)技术的发展使得蛋白质芯片技术的应用范围更加广泛。使用激光脉冲可以把组织里的某一细胞群，例如淋巴滤泡细胞，分离出来作分析。细胞凋亡是免疫系统正常发育和维持所不可缺少的一个调节因素。正常免疫系统的细胞发育是一个受到严格调控的过程，大部分发育中的淋巴细胞都被选择性地清除掉了；相反，在对外来的抗原产生反应时，处于静止期的淋巴细胞必须能够避免凋亡，快速地增殖。与细胞凋亡相关的蛋白质家族，比如BCL-2家族，包含促进细胞凋亡和抑制凋亡的蛋白成员，它们协同作用，共同维持免疫过程的平衡。滤泡性淋巴瘤存在t(14；18)易位，引起了BCL-2蛋白的过量表达，结果造成滤泡内环境调节的紊乱。蛋白质芯片有望成为白血病和淋巴瘤的诊断工具，可以发现肿瘤组织中功能活跃的蛋白质，寻找生物治疗的新靶点。
综上所述，白血病和淋巴瘤的分子诊断已经进入了临床常规诊断，需要注意的是，临床工作者在进行分子检测之前，应该清楚该项目的应用对象和临床意义，实验方法的优缺点，正确地分析、解释检测结果。
编辑：范伟伟
