江苏省南通市通州区结核病医院 金建东
【摘要】目的 探讨荧光定量PCR(FQ-PCR)检测痰中结核杆菌DNA 的诊断价值及其临床应用。方法 对51例初步诊断为肺结核的初治患者，20例其他肺病患者痰标本进行直接涂片、浓集涂片找抗酸杆菌，痰结核杆菌培养和FQ-PCR检测TB-DNA。结果 FQ-PCR法敏感度最高，与其他三种检测方法比较差异有统计学意义(P< 0.05)。结论 涂片检查结核杆菌应提倡浓集法，FQ-PCR法检测TB-DNA应列入TB实验诊断的常规项目。
【关键词】 痰 结核杆菌 FQ-PCR
传统结核杆菌检测，痰直接涂片抗酸染色计数阳性率低。浓集涂片找抗酸杆菌敏感度特异性提高，但不理想。结核杆菌培养法周期太长。本研究采用Taqman荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术，检测痰标本结核杆菌DNA。在FQ-PCR检测痰TB的应用中，痰标本的留取和前处理将直接影响检测的灵敏度和结果的准确性。本文采用胰酶消化法对痰标本进行处理，再行FQ-PCR检测，提高了检出率使定量结果更趋于准确。现报告分析如下。
1 材料与方法
1．1 一般资料 取自本院2007年8月～2010年1月肺结核患者51例，病例人选根据临床症状、体征及胸部x线表现初步诊断为肺结核的初治病人；20例其他肺病患者其中细菌性肺炎9例，慢阻肺11例，本组标本涂片未查到结核杆菌，临床无结核证据，均未经抗痨治疗。
1．2 痰标本收集 标本收集前清洗和灭菌处理一批带盖样本盒，交由护士并由病人自行留取痰标本。嘱咐要求病人晨起后漱口，深咳出1～2口痰入样本盒，加盖送检，样本应避免混入唾沫。涂片镜检应有大量上皮细胞及尘细胞，否则重留。
1．3 试剂和仪器 胰酶消化液，称取10 g胰酶溶于200 ml蒸馏水，用2% NaOH 调pH 至8.0，加25 mmol/L CaCl 22 ml。4 ℃保存至少1年，另用前37℃ 水箱温育10 min。FQ-PCR试剂盒由科华公司提供。仪器由Roche公司生产LightCycler荧光定量分析仪分析。
1．4 统计学处理 应用SPSS 12.0软件系统，组间比较采用t 检验。
1．5 方法
1．5．1 痰标本消化处理 初步估计痰标本量，加入等量混匀的胰酶悬液，用消毒棉签搅动痰液，使二者充分接触，静置30 min至充分液化无痰丝，吸取0.5 ml 加入Eppendorf 管中，10000 r/min离心5 min，弃上清液，沉淀加生理盐水1 ml。振荡洗涤沉淀后10000 r/min离心5 min。如此两次，弃上清液，沉淀用做TB-DNA提取(剩余消化痰液取沉渣涂片作抗酸染色)。
1．5．2 TB-DNA 提取沉淀物加DNA提取液50 ul，振荡混匀，沸水浴10 min，10000 r/min离心5 min，上清液用于DNA 扩增。
1．5．3 操作按照试剂使用说明，对待测血清标本、阴性对照、阳性对照、阳性标准品的DNA 进行提取，取各管模板加入PCR反应管中，按规定的循环参数进行PCR反应。反应结束后，利用阳性梯度标准品的循环阈值(Ct)值，制成标准曲线，再根据样品的Ct值准确定出起始DNA的拷贝数。
2 结果
51例肺结核、20例其他肺病患者痰标本直接涂片、浓集涂片、培养、PCR检测结果，见表1。直接涂片与痰浓集涂片比较差异有统计学意义(P< 0.05)；痰浓集涂片与痰培养比较差异无统计学意义(P> 0.05)；FQ-PCR与其他三种检测方法比较差异有统计学意义(P< 0.05)。
3 讨论
结核杆菌检测，传统的抗酸杆菌涂片染色镜检，检出率低，干扰因素多，系统及人为引起的误差大。“金标准”的结核菌培养，需45天费时过长，要求条件高。FQ-PCR 简便快捷，灵敏度高，重复性好。本研究应用上述几种方法分别对51例已确诊的结核病标本(包括菌阳和菌阴)进行检测，其阳性率分别为21.5% 、35.2% 、33.3% 和72.5%，显示FQ-PCR法在检测结核菌与其他方法相比，灵敏度方面有显著性差异(P< 0.05)，其检出极限为< 1000拷贝/ml，适合应用于结核病的临床快速病源学诊断。
本研究直接涂片、浓集涂片和培养结果均略高于其他报道，主要得益于痰标本的收集和痰标本消化处理方法。附表可见在其他肺病中直接涂片、浓集涂片和培养检出率为0时，FQ-PCR仍有5 的阳性率。经复查仍然为阳性，其结果可能足合并轻度感染且低水平复制，而临床症状被掩盖。目前结核杆菌培养仍是诊断肺结核的最重要标准，尤其是药敏实验在指导临床用药及耐药性检测等方面具有重要作用，是浓集涂片法和FQ-PCR法还无法替代的，但其耗时太长则有待改进。本文认为将上述三种方法同时使用，浓集涂片法和FQ-PCR法可为临床及时提供诊断依据，培养及药敏试验可指导临床用药，FQ-PCR定量检测TB-DNA浓度可用于判断疗效。FQ-PCR应列入TB实验诊断的常规项目。
本研究得到南通大学附属医院大力支持和帮助，谨此致谢。
编辑：范伟伟
