山西医科大学法医学院 王雪彦
传统聚合酶链反应（PCR）技术在应用中,由于PCR 产物需经过琼脂糖凝胶电泳和紫外线检测，产物易污染造成假阳性，且只能做到定性检测。近年来出现的核酸定量PCR 技术,尤其是实时荧光定量PCR （real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR）技术［1］，实现了PCR 由定性到定量的飞跃。FQ-PCR 技术是在PCR 定性技术基础上发展起来的一种核酸定量和分析技术，该技术融汇了PCR 的高灵敏性、DNA 杂交技术的高特异性和光谱技术的高精确定量优点，且操作简便、污染少，已成为分子生物学等许多研究及应用科学中的重要工具。
1 FQ-PCR 技术的原理
FQ-PCR 技术是在PCR 反应体系中加入能特异标记PCR 产物的荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法［2］。在该项技术中：①Tag 酶5′→3′外切核酸酶活性: 用于荧光定量PCR 的Tag 酶，不仅有延伸DNA 引物的活性（DNA 聚合酶活性），还有5′→3′外切酶活性，可以在链延伸过程中实现链替换，并将被替换的单链切断。②荧光标记探针：在荧光定量PCR 的反应体系中，除有2 条普通的引物外，还有1 条荧光标记的基因探针。这条探针的5′端和3′端分别标记了一个特殊基团，5′端的基团称为荧光指示基因（R），3′端的基团称为荧光淬灭基因（Q）。当这条探针保持完整时，Q 基团将抑制R基团的荧光信号，一旦探针被切断，抑制作用消失，R 基团的荧光信号就可以被检测到。③荧光PCR 技术的实现: 上述荧光标记探针根据碱基配对原理与待扩增的核酸序列结合。PCR 反应开始后， 随着链的延伸，Tag 酶沿着DNA 模板移动到荧光标记探针结合位置，发挥它的5′→3′外切核酸酶活性，将荧光探针切断，释放出R 基团的荧光信号。被释放的游离R 基团的数目和PCR 产物的数量是一对一的关系，随着反应时间的进行， 监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。根据PCR 反应体系中的荧光强度即可计算出初始DNA模板的数量［3］。为了便于对所检测样本进行比较，在FQ-PCR反应的指数期，首先需设定一个荧光信号的域值，这个域值一般是以PCR 反应的前15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号， 荧光域值的缺省设置是3～5 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。若检测到的荧光信号超过域值则被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数（Ct）。Ct 值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。每个模板的Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct 值，因此只要获得未知样品的Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
2 FQ-PCR 技术的主要类型
2.1 Tagman 及TagmanMGB 技术： Tagman 技术是在PCR 反应体系中引入了一个寡核苷酸探针， 该探针与被扩增DNA序列特异结合的部位处于两端引物的中部。Tagman 探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种： 普通Tagman探针和TagmanMGB 探针［4］。①Tagman 探针是一种水解型寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关，它与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。当完整的Tagman探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3′端的淬灭剂接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5′→3′外切酶活性将探针切断， 使得荧光基团与淬灭剂分离而发射荧光。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此Tagman 探针检测的是积累荧光， 荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系［5］。②TagmanMGB 探针的3′端标记的荧光淬灭基团是一种非荧光淬灭基团（non-fluorescent quencher），本身不产生荧光，可以大大降低本底荧光，从而提高了分辨率。探针3′端另结合了MGB（minor groove binder）修饰基团，也使得探针的Tm 值有了近10 ℃的提高，也就提高了配对序列与非配对序列的差异，从而使探针的杂交稳定性和特异性显著增强［6］。因此一些无法设计常规Tagman 探针的目的基因片段也可以很容易地设计出TagmanMGB 探针， 从而可提高此方法的可行性。
2.2 分子灯标： 分子灯标是一种在靶DNA 不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针［7］。与Tagman 探针不同的是，该探针5′和3′末端自身可形成约8 bp 的发卡结构， 此时荧光分子和淬灭分子邻近，因此不会产生荧光。当特异模板与该探针杂交时，破坏了探针茎环结构产生的荧光共振能量传递（FRET），淬灭作用被解除，于是便产生荧光，荧光的强度与模板的量呈正比。基于分子灯标原理，可使用以下两种引物：①发卡式引物［8］，特点是所有的扩增产物均能标记上荧光分子，因此荧光信号响应快，但无法区分特异和非特异扩增是致命的不足。②蝎状引物是对发卡式引物的进一步改进［9］，该技术在引物与分子灯标探针之间连接一个间隔臂，使PCR延伸反应时不能够延伸至分子灯标，这样非特异扩增产物便无荧光信号，但当有特异扩增产物时，分子灯标即可与扩增产物进行分子内杂交，产生荧光信号。这样既解决了非特异问题，又保留了其响应快的特点，但是仍存在杂交时探针不能完全与模板匹配及合成复杂的问题。
2.3 双杂交探针：该技术将荧光分子和淬灭分子分别标记在2 个不同的探针上，形成发光探针和淬灭探针［10］。发光探针的5′端与淬灭探针的3′端分别连接荧光分子。两探针设计为可与模板同一条链相邻的序列杂交。杂交时两探针的荧光分子和淬灭分子紧密相邻，从而发生FRET，使荧光淬灭的程度与起始模板的量呈反比，以此进行定量分析。该方法特异性高，但由于2 个探针结合于模板上，因此影响扩增效率。此外，由于需合成2 个较长探针，合成成本高。
3 FQ-PCR 技术在核酸检测中的应用
3.1 病毒感染的定量监测：FQ-PCR 主要是被运用于科研和临床诊断领域的扩增技术。由于它不仅能对病毒定性，而且实验的批间和批内差异小，重复性好。因此能方便、快速、灵敏、准确地定量病毒DNA 或RNA 的序列。这不仅推进了病毒载量和疾病进展关系的研究，而且更重要的是从中可以动态地研究在整个病程中潜在病毒的复活或持续，为临床抗病毒治疗和耐药及变异提供依据。目前应用较多的是对乙型肝炎病毒（HBV）-DNA、丙型肝炎病毒（HCV）-RNA、人类免疫缺陷病毒（HIV）-DNA 的定量监测［11，12］。
3.2 细胞因子的表达分析： 细胞因子是调节蛋白，它通过调节免疫反应在免疫系统中起核心作用。许多不同类型的细胞都能分泌这种低相对分子质量的蛋白质， 其中包括淋巴细胞、抗原递呈细胞、单核细胞、内皮细胞和成纤维细胞。为了阐明在许多炎症反应、自身免疫性疾病和器官移植排异中的免疫致病途径，细胞因子mRNA 表达谱的可靠定量是很重要的。由于被检样本中细胞因子含量往往极低， 所以FQ-PCR以其高敏感性和准确性检测细胞因子mRNA 的表达水平就显得更为重要［13，14］。
3.3 肿瘤基因检测： 尽管肿瘤发病的分子机制尚未完全阐明，但相关基因的遗传学改变的积累是致癌转变的根本原因已被广泛接受。癌基因的表达增加和突变在许多肿瘤早期和良性阶段就可出现，FQ-PCR 不但能有效地检测基因的突变，而且能准确测定其表达量，根据此进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。尤其是在肿瘤患者手术前后检测mRNA，对预测肿瘤转移、复发及疗效观察有重要的临床价值［15］。
3.4 法医学应用： 使用FQ-PCR 对微量及降解生物进行DNA 分型，以其快速、简便、识别率高为法医学个人识别和亲子鉴定开辟了广阔天地。并且采用此项技术定量检测组织中相关损伤因子mRNA 的变化来进行损伤时间的推断［16］。另外，通过定量检测死后不同组织中基因mRNA 的降解规律来研究其用于死亡时间的推断［17］，并提供良好的研究价值。实时FQ-PCR 作为一种定量技术，在以往的PCR 技术上得到进一步发展，大大降低了假阳性率，工作效率高，结果重现性好，且不必使用对人体有害的染色剂。因此，在临床诊断和人群分子流行病学调查、法医学实验室等，都有广阔的应用前景。
参考文献
1 Higuch IR，Fockler C，Dollinger G，et al. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions.Biotechnology，1993，11:1026.
2 Wall SJ，Edward DR. Quantitative reverse transcription -polymerase chain reaction (RT-PCR): a comparison of prime-dropping，competitive，and real-time RT-PCRs. Anal Biochem，2002，300(2):269-273.
3 Eun AJ，Seoh M，Wong S，et al. Simultaneous quantitation of two orchid viruses by the TaqMan real-time RT-PCR. J Virol Methods，2000，87(1-2):151-160.
4 蔡霞.定量PCR 技术及其应用现状.现代诊断与治疗，2005，16(2):112-115.
5 孔德明，古珑，沈含熙，等.TaqMan 分子灯标:一种新型的荧光基因检测探针.化学学报，2003，61(5):755-759.
6 Kutyavin IV，Afonina IA，Mills A，et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension tempera tures. Nucleic Acids Res，2000，28(2):655.
7 Vet JA，Majithia AR，Marras SA，et al. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons. Proc Natl Acad Sci USA，1999，96:6394-6399.
8 Winndeen ES. Direct fluorescence detection of allele specific PCR products using novel energyt ransfer labeled primers. Mol Diagn，1998，3(4):217-221.
9 Whitcombed D，Theaker J，Guy SP，et al. Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence. Nat Biotechnol，1999，17(8):804-807.
10 Brechtbuehl K，Whalley SA，Dusheiko GM，et al. A rapid realtime quantitative polymerase chain reaction forhepatitis B virus. J Virol Methods，2001，93 (1-2):105-113.
11 杨柳，苏明权，岳乔红，等.荧光定量PCR 在HBV-DNA 定量检测中的应用. 中华综合临床医学杂志，2004，6(11):25-27.
12 Foulongne V，Montes B，Didelot-Rousseau MN，et al. Comparison of the LCx human immunodeficiency virus (HIV) RNA quantitative，real-time HIV，and COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan assays for quantitation of HIV type 1 RNA in plasma. J Clin Microbiol，2006，44(8):2963-2966.
13 Wong ML，Medrano JF. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques，2005，39(1):75-85.
14 Gao F，Lu YM，Cao ML，et al. Expression and quantification of LYVE-1 in human colorectal cancer. Clin Exp Med，2006，6(2):65-71.
15 汪洋，宫琳琳，邵淑娟.实时荧光定量PCR 在肿瘤研究中的应用.肿瘤，2004，24(2):196-197.
16 Masataka T，Kiyoshi SRK，Nori N，et al. Studies on mRNA expression of tissue-type plasminogen activator in bruises for wound age estimation. Int J Legal Med，2005，119:16-21.
17 朱方成，蔡成忠，王树法，等. 荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应检测大鼠死后肾mRNA. 中国现代医学杂志，2006，16(11):1628-1630.
编辑：范伟伟
