南京军区南京总医院解放军医学检验中心 罗以勤, 虞伟, 谈华, 武建国
摘要: 目的: 比较聚合酶链反应-微孔板杂交法(PCR-MPH ) 和聚合酶链反应-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PCR-PAGE) 检测肿瘤组织端粒酶活性的临床价值。 方法: PCR-MPH 以地高辛标记端粒重复片段特异的探针与PCR变性产物杂交, 经酶底物显色, 通过测定吸光度判断结果; PCR-PAGE 方法直接用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离PCR 扩增端粒酶的合成产物, 经银染色, 分析端粒酶活性。 结果: PCR-MPH 方法能准确、特异地检测出肿瘤组织的端粒酶活性, 其灵敏度比PCR-PAGE 法高100 倍。 结论: 两种方法均可用于临床检测, 只是PCR-MPH 方法更简单、方便一些。
关键词: 聚合酶链反应; 端粒酶; 肿瘤组织
0 引言
端粒酶是近年发现的一种独特的DNA 聚合酶, 以其自身携带含RNA 模板而有别于一般纯蛋白的逆转录DNA 聚合酶。目前已知端粒酶与细胞衰老及细胞分裂过程密切相关, 尤其在恶性肿瘤组织中存在异常高的端粒酶活性1 。因此, 测定肿瘤组织或脱落细胞等端粒酶活性在肿瘤的诊断和治疗中有重大意义。我们采用本室建立的聚合酶链反应-微孔板杂交法(PCR-MPH ) 和聚合酶链反应-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PCR-PAGE) 2 , 对各类细胞穿刺标本端粒酶活性进行了检测, 取得良好结果, 现报告如下。
1 材料与方法
1. 1 引物和探针合成 两种TS 引物序列为5’Biotin-AA TCCGTCGA GCA GA GTT-3’, 5’- AA TCCGTCGA GCA GA GTT-3’, CX 为5’- CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA -3’。探针为5’Digoxin-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAAA -3。由上海生工生物工程公司合成。
1. 2 主要试剂与仪器 裂解缓冲液、DNA 聚合酶(Taq 酶)、三磷酸核苷酸(dNTP) (生工生物工程公司产品) ; 对硝基苯基磷酸二钠(PNPP )、亲合素(Amrexo 产品) , 碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体(Sigma 产品)。9600 型PCR 扩增仪(美国Perkin Elmer 公司) , 聚丙烯酰胺凝胶电泳仪(美国Bio-Rad 公司)。
1. 3 材料来源
1. 3. 1 组织细胞 均为细针穿刺标本, 其中乳腺癌14 例, 远端转移癌6 例, 其他恶性肿瘤9 例, 炎性包块和良性增生组织17 例, 正常组织7 例。冻存于- 70℃冰箱待检。
1. 3. 2 培养细胞 小鼠骨髓瘤细胞株(Sp 2/0)
1. 4 方法I (PCR-PAGE)
1. 4. 1 端粒酶模板制备 取收集的细胞标本于1.5 ml Eppendorf 管中, 用无菌等渗盐水洗涤后, 离心去上清, 打散沉淀, 加入预冷的裂解液20 ul, 混匀,置4℃ 1 h, 4℃ 10 000 r/min 离心10min, 上清液测定蛋白含量, 用裂解液调整浓度至30 ug/ml, 于- 20℃冻存备用。
1. 4. 2 PCR 条件 50 uL 反应体系中含10 ×TARP 缓冲液5 uL, dNTP 1 uL(50 umol/L ) , Taq-DNA 聚合酶0.5 uL(2 U ) , T 4g32 蛋白0.2 uL (1ug) , TS 引物1 uL(100 ng) , 模板2 uL,DEPC 灭菌水39 uL。于PCR 扩增仪上30℃保温20 min 后, 加入CX 引物1 uL (100 ng)。然后94℃ 热变性45 s, 50℃45 s 退火, 72℃ 60 s 延伸, 共31 个循环, 最后于72℃延伸5 min。
1. 4. 3 PCR 产物浓缩、电泳和银染 于PCR 产物加入24∶1 的氯仿∶异戊醇50 uL, 混匀, 10 000 r/min 离心5 min, 吸取上层液置另一0.5 ml Eppendorf 管中, 加入3 mol/L 醋酸钠5 uL 和2 倍体积预冷的无水乙醇, 混匀后置- 20℃ 2 h, 取出后于4℃,15 000 r/min 离心20 m in, 弃上清, 留沉淀吹干, 用DEPC 灭菌水10 uL 溶解, 加上样缓冲液5 uL, 在电压为180 V , 10% 不变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳50m in。电泳结束后, 将凝胶取出置10% 乙醇固定5 m in, 再用1% 硝酸浸泡5 m in, 硝酸银染色10 m in,最后用碳酸钠显色液显色, 待观察到全部条带显色,即用10% 的冰乙酸终止反应, 制膜保存。
1. 5 方法II (PCR-MPH)
1. 5. 1 端粒酶模板制备 同上。
1. 5. 2 端粒酶扩增 同上, 但TS 为生物素标记的引物。
1. 5. 3 微孔板杂交 将亲合素以10 uL/ml、100 uL/孔包被聚苯乙烯板, 4℃过夜。次日用pH 7.4 0.01 mol/L PBS 洗3 次。各孔以300 uL, 1.0 g/L 的明胶封闭, 37℃温育2 h, 用PBS 洗3 次, 倒置于干净滤纸待干, - 20℃贮存备用。取0.6mol/L N aOH与PCR 扩增产物等量混合, 室温下10 m in。于微孔板中加入100 uL 杂交液(0.25 g Ficoll 400、0.25 g BSA、0.25 g PV P 、0.0625 g/L 牛DNA、20×SSC 31.25 ml , 1 mol/L HCl 375 ml, 加水至1 L , 内含2.5 umol/L 标记地高辛的探针) 和25 uL变性液混合, 37℃ 1 h 进行杂交反应。用pH 7.4 PBS 3 次洗板后, 加入用pH 7.4 PBS 1∶2 000 稀释的碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体100 uL, 37℃下40m in, 洗板3 次, 加入1.0 mg/L 的PNPP 底物100 uL, 室温下避光作用30 m in, 再加入终止液( 2 mol/L NaOH) 50 uL, 于405 nm 测定吸光度(A ) 值。
2 结果
2. 1 PCR-MPH 和PCR-PAGE 的特异性试验 PCR-PAGE 以出现5 条以上间隔6 个核苷酸的DNA 片段梯度示有端粒酶活性(阳性) (图1)。该法测定细胞株Sp 2/0 显示端粒酶阳性, 而用加热灭活的Sp 2/0 细胞株和正常组织细胞, 则显示端粒酶为阴性。PCR-MPH 测定结果与上法相同, 端粒酶阳性细胞株Sp 2/0 A 值为0.920, 而灭活的Sp 2/0 细胞株和正常组织分别为0.116、0.112。
2. 2 PCR-MPH 和PCR-PAGE 的灵敏度试验 将小鼠骨髓瘤细胞株(Sp 2/0 ) 用裂解液处理后, 再以裂解液按100、10-1、10-2??10-7稀释后进行扩增,用两种方法检测产物。结果PCR-MPH 法(灵敏度为10-5 ) 比PCR-PAGE 法(灵敏度为10-3 ) 高100倍。
2. 3 临床样本检测 用PCR-MPH 和PCR-PAGE对53 份样本进行了检测, 结果见表1。
3 讨论
目前, 国外普遍应用检测端粒酶的方法为端粒重复序列扩增分析同位素掺入标记法, 即放射自显影法, 但该法使用放射性同位素, 易有放射性污染,且操作烦琐3 。我室在此基础上建立两种检测端粒酶方法(PCR-MPH 和PCR-PAGE) 对各类细胞穿刺标本及小鼠骨髓瘤细胞株(Sp 2/0) 端粒酶活性检测, 取得了较为满意的结果。对临床53 份标本检测结果表明, 7 份正常组织全部为阴性, 与病理诊断的符合率为100%; 病理诊断为乳腺癌的标本(14 份)和远端转移癌(6 份) , 经PCR 扩增后, PCR-MPH和PCR-PAGE 法检出率均为100% 和66.7% , 两法检出符合率100%。9 份病理诊断为其他恶性肿瘤标本中有1 例PCR-PAGE 法检测为端粒酶阴性, 而PCR-MPH 法阳性, 这可能是因为标本中模板量低,而PCR-PAGE 法检测灵敏度低于PCR-MPH 法所致。两法对17 份炎性包块和良性增生组织检测符合率也是100% , 其中2 例为端粒酶阳性, 据报道端粒酶活性也可见于某些良性增生和炎性组织中, 但酶活性程度较恶性肿瘤弱得多4 , 是否为癌前病变有待于进一步研究证实。PCR-MPH 和PCR-PAGE 法对29 例经病理诊断的肿瘤组织端粒酶总阳性率分别为89.6% (25/29) 和86.2% (26/29) , 与文献报道一致5 。
本研究结果表明, PCR-MPH 法具有以下优点:①有较好的特异性和稳定性, 所需时间短, 杂交灵敏度明显高于PCR-PAGE (100 倍) , 操作简便, 试剂易购。②酶标仪读取结果客观, 可避免电泳法观察中的人为干扰。③可进行PCR 定量分析。④便于大量常规临床标本定性或定量检测。⑤无放射性污染。因此, PCR-MPH 法是检测端粒酶活性较理想的方法,将有更广泛的应用前景。
参考文献:
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2 虞伟, 谈华, 武建国, 等. 端粒酶重复序列扩增2银染法用于端粒酶活性测定的研究[J . 医学研究生学报, 2000, 13 (2) : 96-98.
3 Kim NW , PcatyszekMA. P row se KR, et al Specific association of human telomerase activity w ith immo rtal cells and cancer [J . Science, 1994, 226: 2011-2014.
4 Uede M , Ouh tit T, Bito T, et al. Evidence fo r UV -associated activation of telomerase in human sk in [J . Cancer Res, 1997,57: 370.
5 Klim stra D, V enkatraman EM ,Moo r MA , et al. H igh telomerase activity in p rimary lung cancers: assciastion with increased cell proliferation rates and advanced patholojic stage [J . J N atl cancer Inst, 1997, 809: 1609-1615.
编辑：范伟伟
