上海市血液中心 王迅
输血相关传染病的预防和控制已经成为全社会关注的焦点，而新技术的引进是进一步提高血液安全性的重要一环。笔者就病原体核酸检测技术(nucleic acid testing，NAT)及其在血液筛检中的应用情况作一介绍，并对该方法在我国推广和应用的必要性和可行性作初步探讨。
1 NAT及其在血液筛检中的必要性
目前，酶免检测(EIA)技术已经广泛运用于血液筛检，虽然该方法的灵敏度和特异性一直在不断地改进和提高，但每年仍有少数新发输血后肝炎病例报道，如美国无偿献血者每单位供血传播HBV、HCV 和HIV的危险性分别为1：66000、1：103000和1：676000[1]。这些危险主要来自：病毒感染者“窗口期”献血，病毒变异，免疫静默感染(immunosilem infection)以及人工操作错误[2]。所谓“窗口期”，是指从感染病原开始，直至用某种检测方法能够检测到该病原存在为止的这一段时间[3]。由于感染后病毒颗粒先于抗原、抗体释放入血，如HCV 感染后，在长达1～3个月的时间里，感染者体内没有或仅有微量而无法检测出的抗体，而血液具有传染性。因此抗原、抗体检测的“窗口期”较长，如HBsAg、抗-HIV检测的“窗口期”分别为56d和22d，抗-HCV检测的“窗口期”则长达72d[4]，故美国90% 以上输血传播HIV和HBV以及75% 以上输血传播HCV 的危险性均来自“窗口期”感染献血[5]。1995～1998年上海市输血后肝炎调查的研究中，发现的2例输血后肝炎病例均是输用“窗口期”感染的血液引起[6]，因此，EIA的“窗口期”漏检是当前影响血液安全性进一步提高的瓶颈，对于献血者的筛选，单纯检测抗原或抗体不能有效地保障血液安全。
NAT是一系列直接检测病原体核酸的技术的总称，主要原理是使用一些物理、化学和生物学方法，通过靶核酸直接扩增或其附带的信号扩增的方法，让看不见的极微量的核酸变成直观的光电或可视信号，从而判断标本中是否存在相应的病原体。NAT敏感性高，可检出标本中极微量的核酸，甚至在病毒感染后数天即能检出，大大缩短了“窗口期”。初步研究表明，NAT可将HBV、HCV和HIV感染的平均“窗口期”缩短25d(缩短“窗口期”50% )、59d(89% )和11d(50% )[7]；此外NAT还可以检出因上述其它3种原因而漏检的被感染献血。如法国应用NAT，从大约150万份献血中筛检出4份HCV RNA阳性、抗体阴性的样本，其中1份即为免疫静默感染[8]。尽管NAT从理论上并不能完全消除感染“窗口期”，但病毒核酸转阳之前的血液传染性极低，可以有效地预防经输血传播病毒性疾病[9]。因此，NAT 的引入可使输血传播疾病的危险性降到最低[10] 。
2 NAT 的几种方法
1985年具有划时代意义的聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)的发明，标志着NAT的诞生。随后，在PCR的基础上，派生出许多其它原理的体外NAT方法，主要分为PCR扩增方法、逆转录依赖的扩增方法及其它NAT方法3大类[11]。这些技术灵敏度和特异性或高或低，操作或简单或复杂，适合在各自不同的领域运用，它们之间的比较见表1。
2．1 PCR扩增方法 PCR是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，以其高敏感性、高特异性和快速简便等优势得到了广泛的应用。通过简单的技术改进和联合，涌现出了各种各样不同的PCR方法，如检测RNA 的逆转录PCR (RT-PCR)、敏感性和特异性均较高的巢式PCR(nested-PCR)、可对靶序列进行定量检测的定量PCR、检测基因超长分布的多重PCR以及PCR结合酶标技术(PCR-ELISA)、PCR结合寡核酸探针杂交技术(PCR-SSOP)、荧光PCR和免疫PCR等。目前在临床检测中使用较多的是荧光定量PCR，主要用于各种传染病的诊断、病毒滴度监测以及疗效评估，因采用荧光标记的探针杂交或直接使用能和双链DNA结合的荧光素检测PCR扩增产物，进一步提高了检测的敏感性和特异性。若加入已知浓度的内标或外标，便能进行定量检测。由于该方法实现了反应体系的全封闭和操作的全自动，不仅减少了污染，还提高了效率。目前已经有少数国内血浆制品生产企业应用荧光PCR在原料浆投产前进行HBV、HCV和HIV的筛检。
虽然国内许多生物技术企业已经利用荧光PCR方法开发出成熟的NAT定量检测产品，如深圳匹基、广州达安、上海复星、上海科华等，但这些产品均只获得我国食品和药品监督部门的临床诊断使用许可证。而临床诊断和血液筛检是2个不同的应用领域，血液筛检对试剂的要求要比临床诊断高很多。迄今为止正式通过美国FDA认证可用于血液筛检的试剂仅有2种，即Roche COBAS AmpliScreen HBV/HCV/HIV 和Chiron Procleix TMA HIV-1/HCV 检测系统，FDA评判这些试剂是否能用于血液筛检的标准之一为：必须对50 cp/ml 的病毒核酸的检出率>95%。相当一部分国产荧光定量PCR检测试剂或许能在某些标本上获得20 cp/ml 的灵敏度，但一般都很难满足95% 检出低病毒载量标本的要求。2002年美国AABB年会上甚至有学者提出血液筛检试剂的灵敏度应该达到(5～6)cp/ml才能保证不至于因为混合检测而造成的漏检，这无疑对血液筛检NAT试剂提出了更高的要求。相信不断提高检测灵敏度，早日研发并注册成功我国自己的NAT血液筛检用试剂也是国内生物技术企业的发展目标。
2．2 逆转录依赖的扩增方法 包括转录介导的扩增系统(transcription mediated amplification，TMA)和核酸序列依赖扩增系统(nucleic acid sequence based amplification，NASBA)。TMA是一种利用逆转录酶、RNA酶H和RNA聚合酶这3种酶的共同作用，在等温条件下来扩增RNA或DNA的反应系统，主要扩增原理为：目标序列在逆转录酶作用下，以引物为引导进行逆转录，RNA酶H将杂合链上的RNA降解以后，形成转录复合体，并在RNA 聚合酶作用下，转录出成千上万个目标RNA序列，这些RNA又可以作为模板进行下一个循环，整个反应是一个自催化过程。NASBA的原理与TMA相似，只是在核酸提取和扩增产物检测的方法上有所不同。这两种方法的特异性强。灵敏度高，反应条件简单，扩增效率高，无需专门的扩增仪器，且因整个反应在1个试管中进行，也减少了污染。有关公司将TMA技术改进为类似于酶免检测那样的洗板和孵育的操作，极大地方便了该技术在血液筛检中应用。
2．3 其它NAT技术 包括支链DNA检测技术(branched DNA signal amplification assay，bDNA)、环介导的等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、连接酶链技术(ligase chain reaction，LCR)和链置换扩增(strand displacement amplification，SDA)等。这些技术或因为自身原因，或因为刚研发出来尚未进入I临床，均未在血液筛检中应用。值得一提的是：在1995年左右推出的bDNA技术，其信号放大是通过碱性磷酸酶(AP)标记的探针杂交结合到一个树枝状核酸枝状体上而实现的。bDNA技术对待测DNA无扩增，特异性较好，能进行病毒定量检测，动态地揭示病毒滴度水平的变化，不仅在预测干扰素疗效方面可为I临床提供更为有用的信息，还可作为丙肝病人对于扰素完全应答的标志反应。但也正因为bDNA技术没有扩增待测核酸，其检测灵敏度远远低于PCR，故该项技术实际上不适合用于血液筛检，目前国内主要将bDNA技术用于HBV或HCV病毒滴度的定量分析。
3 NAT在国内外血液筛检中的应用
NAT是一种新兴的检测方法。许多国家及输血机构都进行了一系列的研究。在国外特别是一些发达国家和地区已普遍应用于血液筛检[12]。例如，日本是世界上最早在全国范围内对血液进行HBV、HCV、HIV-1 NAT筛检的国家[13]，新加坡、中国香港也已经分别采用不同的方式对血液进行NAT筛检；德国和荷兰从1997年起就开始NAT筛检的尝试，英国和法国的部分血站也从2000年起开始了NAT血液筛检；美国则从1999年3月开始在FDA新药审核程序下使用不同的试剂进行常规血液筛检。纵观各国运用NAT进行血液筛检的情况，归纳如下几点经验：
3．1 可行性评估和经验的积累非常重要 NAT血液筛检方法总是从血浆制品的原料浆的筛检开始的，积累了充分的经验后，才逐步应用到血站的采供血系统。例如，欧洲医疗产品规范委员会(CPMP)规定从1999年7月起所有的血浆制品的原料、中试产品和最终产品都应进行HCV PCR检测，当时NAT只在少数血站进行评估，而大部分血站供血系统至今仍未进行NAT筛检；美国早在1994年FDA就曾提出血浆蛋白生产的原料浆必须进行NAT筛检，而血站系统则从1999年才开始全面进行NAT的可行性评估。
3．2 集中筛检模式 以地域为单位建立几个大型的集中式的NAT血筛中心，既便于质量管理，又能节省检测成本。例如，全日本只设3家NAT检测中心，分区域对77家血液中心的标本进行HCV、HBV、HIV核酸检测和分析[14]。又如美国红十字会(ARC)在全美成立了3个NAT检测中心，每天将所有ARC血站采集的血液集中到这3个检测中心进行NAT检测，据测算，尽管血液标本的冷链运输消耗一部分费用，但集中检测的成本仍低于各个血站单独检测。我国香港地区将血液标本送到澳大利亚进行NAT检测也是这个道理。目前，欧洲各国的血站正在进行或已经完成整合，也正是顺应了集中化管理的潮流。
3．3 使用的技术各不相同 日本使用的方法为罗氏公司与日本红十字会共同开发的全自动的AmpliNat NPX系统；美国ARC 和新加坡使用的是Chiron公司的TMA技术；美国血液中心(ABC)系统则使用罗氏COBAS AmpliSereen；荷兰及部分欧洲国家将荷兰阿克苏公司推出的Nucliesens全自动核酸提取方法同罗氏的COBAS AmpliSereen扩增体系结合起来使用；而英国和法国的部分血站在2000年采用的是Qiagen的全自动核酸提取系统与罗氏的COBAS AmpliSereen扩增体系结合起来的方法，随后部分血站又更换成Chiron的TMA技术。各血站根据自身特色，正在对各种不同的技术组合进行评估，目的是寻求一种最适合的NAT技术，既保障血液安全，又能保证血液的及时供给，还要做到省时省力。
3．4 混合样品数逐渐减小 为降低成本，在保证灵敏度的前提下，NAT往往将一定数量的血液标本混合起来检测。NAT检测最初在欧洲普遍流行96人份样本混合检测，随后逐渐更换成48人份，直至目前的24人份混合。TMA刚开始在美国ARC进行评估时，将128份血液标本混合起来检测，随后改成16人份混合。新加坡从一开始就使用单人份血液标本进行NAT检测。这样更改的原因一是可以防止低拷贝的病毒阳性血液的漏检，二是混合样品增多，一旦发现阳性检测结果，进一步拆分混合样品，最终找到阳性血液标本的工作变得复杂耗时，有时还会影响正常的血液供应。
3．5 NAT对提高血液安全确实有帮助 从各国公布的NAT检出的阳性标本资料总结中可以看出，尽管世界发达国家的血液安全水平已经大幅度提高，但是由于EIA “窗口期”所致的漏检概率仍然有几百万分之一、几十万分之一甚至几万分之一，虽然从经济学角度考虑，为了保障每年如此少数几个人的安全而投入大量的人、财、物进行NAT血液筛检，不太经济，然而对于受血者来说，一旦输入感染病毒的血液，被感染的概率就是100% 。因此大多数国家从人权角度考虑，仍然主张在经济允许的条件下开展NAT血液筛检。
我国有关NAT血液筛检研究的报道还比较少见。厦门市中心血站于2000年1～6月利用NASBA技术结合自行设计引物的方法，从10000份献血标本中检出2例抗体阴性、HCV RNA阳性的标本[15]，感染危险性高达1：5000，这可能与检测标本过少和自行设计的扩增体系有关。为对美国Chiron公司的TMA技术在我国血液筛选工作中应用的可行性进行评估，上海市血液中心在2001年3月～2002年3月分两个时间段，对103539份无偿献血标本进行了HCV/HIV-I RNA检测，结果表明上海市的血液安全水平在逐步提高，HCV和HIV的感染危险性已经<1：100000，基本接近发达国家水平[7]。
考虑到我国各地方经济水平不一，检测条件差异较大，操作人员的水平参差不齐，应结合传统的EIA方法，制定一套切实可行的血液筛选规程，使我国的血液安全尽快达到发达国家的水平。另外，进口NAT试剂平均每单位血液需增加100多元的检测费用，这样高额的成本迫使卫生行政部门不得不在生命和经济之间作出艰难的选择。而国产PCR诊断试剂的灵敏度远比FDA批准的试剂要低，而且特异性不高，操作复杂，无法质控，不适合大量样品的检测等缺点也局限了它们在常规血筛中应用。因此，我国现阶段除了引进成熟的NAT血筛技术外，还应研发适合我国国情的新的血液筛检技术，不但可降低相应的检测费用，更有利于新技术在国内的推广，进一步提高我国血液安全水平。
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编辑：范伟伟
