成都医学院医学检验医学院 龚弘局综述，金家贵，程曦审校
【摘要】聚合酶链反应(PCR)技术具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速等优点，目前已广泛应用于寄生虫学、微生物学、肿瘤学、遗传学、免疫学、基因治疗、食品检测、出入境检验检疫等诸多领域。在医学检验工作中，PCR技术的应用，既可保证样品检测的准确性和可靠性，又可节省大量的人力、物力和财力，有巨大的社会和经济效益，具有推广应用价值。本文就各种PCR技术在医学诊断中的应用与进展作一综述。
【关键词】聚合酶链反应； 病原微生物；肿瘤； 遗传病
聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是一项模拟DNA体内复制过程的体外DNA扩增技术，经过变性-退火-延伸过程，25～30个循环后。可使模板DNA片段的数量呈几何级数倍增，为DNA的限制性片段长度多态性分析、基因突变、DNA序列分析、分子系统进化等提供了灵敏、简便、快速的手段，上世纪90年代以来已被广泛用于生物学各领域。然而，常规PCR技术也存在不少问题，如出现非特异性扩增产物、形成引物二聚体等。且传统的PCR技术既费时、费力。其间的污染环节多，容易出现假阳性或假阴性。为克服常规PCR检测技术的不足，人们一直在对传统的PCR技术进行改进。已发展有多重PCR、实时定量PCR技术(reat time PCR，RT-PCR)、荧光定量PCR(FQ-PCR)、实时荧光定量PCR技术、巢式PCR、PCR-酶联免疫吸附试验(ELISA)等。在临床医学检验中，PCR技术的运用日益增多，在寄生虫检验、微生物检验、遗传学检验等方面都得到了广泛的应用。
1 PCR在寄生虫检验中的应用
1．1 疟原虫的PCR检验 疟原虫是疟疾的病原体，其典型的临床症状表现为寒战、高热和出汗退热3个连续阶段。传统的实验室检测常常通过厚、薄血涂片法、血沉棕黄层定量分析法(quantitative buffy coat，QBC)和免疫法等方法进行检测。但由于它们操作繁琐、成本较高，且容易发生漏检。不利于广泛推广。近年来，陈姝等建立的PCR检测恶性疟原虫方法具有敏感、特异、简易和快速的特点，便于现场推广应用。他们通过5对根据恶性疟原虫不同基因序列设计的引物筛选及7种从滤纸干血滴中快速制备疟原虫DNA模板的方法的比较，以建立一种敏感、特异、简便、快速的PCR检测恶性疟原虫的方法。结果表明，根据恶性疟原虫中度重复基因序列pBRK1214设计的引物。可从恶性疟原虫DNA中扩增出206 bp大小的DNA片段，而间日疟原虫、人白细胞DNA均无此扩增带出现，并至少可检测出原虫血症为5×107培养血的感染水平，且适用于我国不同地理株恶性疟原虫的检测；滤纸干血滴样本经生理盐水溶血煮沸法处理的PCR扩增效果最为理想，且简易、经济、重复性好；在云南疟疾流行区采集的360份血样中，PCR法与镜检法符合率为97.5%，故可以批量检查，应用于疟原虫的诊断，其敏感性、稳定性具有其他检测技术无法比拟的优点。
1．2 华支睾吸虫的PCR检验 华支睾吸虫是一种常见的人畜共患寄生虫，生食或半生食含有华支睾吸虫囊蚴的淡水鱼、虾可引起华支睾吸虫病。传统的病原学检测，通常采用镜检检查华支睾吸虫的虫卵，但由于其虫卵较小，容易漏诊。然而，镜检法有时不能够发现处于中间宿主发育阶段的吸虫，而现有的ELISA法敏感性和特异性都不高[1]。目前国内外免疫学诊断时则应用的华支睾吸虫成虫可溶性抗原或成虫切片抗原进行检测，由于抗原表位复杂，与其他寄生虫病有交叉反应而出现假阳性。分子生物学技术用于华支睾吸虫病检测的研究很少，因此，寻找灵敏性和特异性高而且操作简便的新方法对华支睾吸虫的检测具有霞要意义。张媛等[2]建立的华支睾吸虫特异性引物和探针的特异性和灵敏性均较高，说明PCR和实时荧光PCR用于定性和定量检测华支睾吸虫有很好的应用前景，为疾病的诊治和预防提供了较好的技术手段和方法依据[2-3]。
2 PCR技术在病毒检验中的应用
2．1 乙型脑炎(下称乙脑)病毒的PCR检验 乙脑病毒是流行性乙脑的病原体，常通过蚊子的叮咬进入人体，主要引起流行性乙型脑膜炎。目前，在进行乙脑病毒的检查中实验审普遍采用的是血清学诊断，即运用ELISA法测定特异性IgM，其敏感性和特异性相对较高。但仍有部分患者，如特异性IgM还未产生的早期患者和免疫应答处于抑制状态的重症患者，均无法检测到特异性IgM。故血清学检测作为早期诊断方法仍有一定的局限性。因此，对临床上怀疑为乙脑而特异性IgM却为阴性的患者，检出其病毒核酸就显得特别重要。孙静等采用RT-PCR用于l临床疑似乙脑患者血清及脑脊液标本的检测，并与反向被动血凝抑制实验方法进行比较。结果显示RT-PCR敏感性可达64PFU，对脑脊液中流行性乙脑病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)的检测率明显高于反向被动血凝抑制实验[4-5]。黄福新等[6]采用TaqMan技术。利用RT-PCR方法来检测JEV，为乙脑的早期应急及临床诊治提供准确可靠的检测手段。阳帆等[7]建立的TaqMan PCR方法，从临床样本RNA的提取到结果的判定，最快能够在11.5 h内完成，并且TaqMan PCR法省去了传统PCR检测扩增后处理的繁琐步骤。进一步缩短了分析时间。同时，此检验方法的特异性强、可靠性好、敏感性高、操作简单、快速等优点均适用于乙脑病毒的快速检测，便于在临床上广泛推广。总之。TaqMan PCR通过实时检测体系中的荧光强度动态变化进行定性、定量分析的核酸体外扩增检测技术，比普通PCR更加简便、快捷、灵敏、特异，并且减少了污染环节，具有广泛的应用前景。
2．2 乙型肝炎(下称乙肝)病毒的PCR检验 目前，实验室多采用乙肝两对半或ELISA法进行乙肝病毒的检测。乙肝两对半或ELISA法用于疾病的早期诊断，其灵敏度不高，容易出现假阳性，但FQ-PCR法较之具有更高的灵敏度，且所需样品量少。罗进等利用荧光PCR检测乙肝病毒共价闭合环状DNA(covalenty closed circular DNA，cccDNA)的方法，操作简单、灵敏度高、特异性强，适用于检测血清中HBV cccDNA，为实验室检测的金标准[8]。与传统的乙肝两对半和ELISA相比，FQ-PCR法特异性强、灵敏度高，检测乙肝病毒准确、高效，值得推广。
2．3 肠道病毒的PCR检验 一般认为PCR目前为肠道病毒感染诊断的承要手段，但雷永良等根据其提供的引物、反应体系和反应条件对送检标本进行了肠道病毒Cox A16和EV71的核酸检测，认为实时FQ-PCR具有独特的优势和特点：反应和分析在完全闭管的条件下进行，能有效防止PCR产物的污染，提高检测结果的可靠性；试剂在PCR检测仪上进行扩增和分析，无需电泳和紫外灯观测等步骤，从标本处理开始只需要3～4 h即可完成检测，节省了检测时间，提高了检测效率[9-10]。故实时FQ-PCR法具有特异性强、灵敏度高等优点，是一种理想的手足口病肠道病毒的检测方法。
3 PCR技术在细菌检验中的应用
3．1 霍乱弧菌的PCR检验 霍乱弧菌是烈性肠道传染病霍乱的病原体，霍乱属我国甲类传染病，其主要表现为剧烈的呕吐、腹泻、失水，死亡率甚高。传统的霍乱毒素的检测方法主要有动物实验、分离、培养、生化反应和血清学实验等。随着霍乱弧菌基因组测序的完成及对霍乱弧菌分子特征认识的逐步深入，分子生物学技术逐步成为主要的检测手段。曲梅等利用TaqManFQ-PCR方法对分离到的81株霍乱弧菌进行毒力基因的测定，建立起霍乱弧菌毒力基因快速检测的技术方法。有助于分析霍乱的分子流行病学特征，预测流行趋势，为进一步制定霍乱的监测与防控重点，提供实验室依据[11]。采用的TaqMan FQ-PCR检测霍乱弧菌毒力基闪灵敏度高、特异性好，为今后霍乱日常监测和疫情应急处理提供快速检测的平台。故与普通PCR相比，利用FQ-PCR对霍乱弧菌进行检测是分子生物学研究领域中发展起来的一项新技术，具有灵敏度高、特异性好、检测速度快、且操作简便等优点。
3．2 结核分支杆菌的PCR检验 目前，实验室检测一般采用常规微生物学检测方法：如传统的罗氏培养基法。快速培养仪检测系统如BACTEC-TB、液体变色培养基测定法、噬菌体裂解法和荧光索酶测定法均需要作细菌培养，但其耗时长，一般在1周以上，不能达到快速检测的目的。利用PCR方法对结核分支杆菌的rpoB基因扩增基础上进行DNA自动测序，可在1 d内得到结果，该法简便、快速，可作为测定结核分支杆菌的金标准。李敏等[12]利用双重PCR技术对结核及非结核分支杆菌进行鉴别，并且在5 h内完成试验，该技术为结核与非结核分支杆菌的快速鉴定提供了又一可供选择的手段。于保东等[13]应用PCR一直接测序法对长春市利福平耐药菌株进行快速检测，了解耐利福平基因突变的部位、性质、数目及发生频率情况，为临床快速检测耐利福平菌株的最好方法。熊国亮等[14]采用套式PCR—DNA测序方法直接检测112例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分支杆菌rpoB基因突变情况。认为套式PCR—DNA测序可望为直接检测临床痰标本中结核分支杆菌耐利福平的准确、特异、快速的方法[15]。由此可见，PCR是快速、准确、简单、廉价的检测临床结核分支杆菌的最好方法之一。
4 肿瘤基因的PCR检验
肝癌是常见的恶性肿瘤，而血行播散则是肿瘤转移的重要途径，所以检测外周血中的肿瘤细胞对判断有无血行播散具有重要意义。目前，诊断肝癌的主要手段多为影像学和血清学检查，但在早期判断肝癌转移方面尚缺乏很好的检测手段。由于肝癌细胞通过血液循环转移到其他组织是其转移的主要方式之一，有学者报道通过逆转录PCR分析外周血中肝癌细胞特征性标志物可以协助分析肝癌转移与预后。他们建立了检测外周血中肿瘤基因的RT-PCR方法，其中以清蛋白的mRNA为靶mRNA，而清蛋白mRNA是肝细胞和肝癌细胞的特异表达产物在外周血中不表达，用于预测肝癌的复发情况。王战坤等[16]采用以Taqman技术为基础的实时FQ-PCR技术，检测各型肝癌患者外周血细胞中AFP mRNA水平，分析外周血中是否存在肝癌细胞，并判断该方法检测肝癌细胞血液转移的可行性。结果认为肝癌患者外周血AFP的mRNA定量检测有助于判断原发性肝癌发生和肿瘤早期血行转移[16]。应用PCR技术检测外周血或骨髓中存在的肿瘤细胞，具有灵敏度高、特异性强的优点，对肿瘤患者的复发、转移和疗效具有良好的临床监测价值[17]。
5 遗传病的PCR检验
遗传病是完全或部分由遗传因素决定的疾病，常为先天性，也可后天发病。如先天愚型、多指(趾)、先天性聋哑、血友病等。这一类遗传病患者给家庭、社会带来了沉重的负担，若能在胎儿出生前特别是妊娠早期，共至在胚胎植入子宫前对孕卵、胚胎或胎儿进行适当的检查，及早了解胎儿的发育是否正常，可有效解除孕妇及家庭的心理负担，利于孕期保健。当胎儿异常时，则在获取分析资料后作出准确的诊断，再选择终止妊娠或进行宫内治疗，以达到减少遗传病患儿和畸形儿出生的目的[18]。所以提高产前诊断技术，保证其准确率就显得尤为重要。传统的产前诊断技术多采用羊水检测、B超、彩超等方法进行监测，但其有灵敏度不高、特异性低、同时对母体及胎儿都有或多或少的不良反应。王学锋等[19]应用PCR方法检测血友病的FVI 基因内、外及FIX 基因外多个位点的多态性并进行遗传连锁分析，就目前来说，PCR是血友病携带者检测与产前诊断的简便、快速、安全的首选方法。
6 PCR技术展望
近年来。分子诊断技术的一大成就即是在PCR技术的基础上衍生出其他的PCR技术。它们弥补了传统PCR技术费时、误诊、成本高等不足。随着各类技术的不断完善，其应用范围将进一步扩大，对肿瘤学、遗传学、免疫学、微生物学、寄生虫学和基因治疗等进一步研究及临床应用起着积极重要的作用。随着科学技术的进步及研究的不断深入，PCR技术在医学检验行业将会更加精准、快速、完善并且得到更为广泛的应用，为人类健康作出更大的贡献。
参考文献
[1] Magalhaes KG，Passos LK，Carvalho Odos s．Detection of Lymnaea columella infection by Fasciola hepatica through multiplex PCR[J]．Mem lnstOswaldo Cruz，2004，99(4)：421-424．
[2] 张媛，童睿，郑秋月，等．PCR和实时荧光PCR方法检测华支睾吸虫[J]．寄生虫病与感染性疾病，2008，6(1)：9-11．
[3] Wongratanacheewin S，Pumidonming W，Sermswan RW，et al．Development of a PCR based method for the detection of Opis thorchis viverrini in experimentally infected hamsters[J]．Parasitology，2001，122：2175-2180．
[4] 孙静，陶三菊，陈伯权，等．逆转录-聚合酶链反应检测乙型脑炎患者标本[J]．中华实验和临床病毒学杂志，2000，14(2)：184-187．
[5] 丁淑军，余光开，张建军，等．逆转录-聚合酶链反应在乙型脑炎诊断巾的建立[J]．中国人兽共患病杂志，2003，19(1)：86-88．
[6] 黄福新，高世同，张仁利，等．乙型脑炎病毒TaqMan逆转录聚合酶链反应检测方法的建立[J]．中国热带医学，2008，8(9)：1481-1482．
[7] 阳帆，刘建军，何建凡，等．TaqMan PCR检测乙型脑炎病毒方法的建立及应用[J]．中国卫生检验杂志，2008，18(10)：1962-1964．
[8] 罗进，郭晏海．荧光PCR检测乙型肝炎病毒cccDNA方法的建立[J]．中国卫生检验杂志，2008，18(7)：1384-1386．
[9] 雷永良，陈秀英，叶碧峰，等．实时荧光定量PCR在手足口病肠道病毒快速检测中的应用[J]．中国病原生物学杂志，2008，3(10)：738-739．
[10] 陈宗波，范希文，董永绥，等．山东地区肠道病毒中枢神经系统感染187例分析[J]．中华儿科杂志。2003，41(3)：199-202．
[11] 曲梅，黄芳，严寒秋，等．TaqMan荧光PCR技术在霍乱弧菌毒力基因检测中的应用[J]．中国预防医学杂志，2008，9(6)：546-549．
[12] 李敏，吕淑陶，赵源，等．应用双重PCR技术快速鉴定结核与非结核分支杆菌[J]．内蒙古农业大学学报，2008，29(1)：85-87．
[13] 于保东，华树成，张艳华，等．聚合酶链反应-直接测序法快速检测结核分支杆菌利福平耐药菌株的研究[J]．中国实验诊断学，2008，12(2)：202-203．
[14] 熊国亮，张慧慧，刘珍琼．套式PCR及测序方法用于痰标本中结核分支杆菌rpoB耐药基因突变检测[J]．中国防痨杂志，2006，28(1)：11-13．
[15] 刘珍琼，刘金辉，熊国亮。等．套式PCR及测序法检测痰中结核分支杆菌耐乙胺丁醇embB基因突变[J]．江西医学院学报．2008，48(4)：22-24．
[16] 王战坤，邵俊斌，陈智，等．实时荧光定量PCR检测肝癌患者外周血甲胎蛋白mRNA水平[J]．中华内科杂志，2003，42(10)：722-723．
[17] 汪洋，官琳琳，邵淑娟，等．实时荧光定量PCR在肿瘤研究中的应用[J]．肿瘤，2004，24(2)：196-197．
[18] 周风娟．遗传病诊断的特殊手段[J]．生物学教学，2006，31(12)：52-53．
[19] 王学锋，刘元肪，刘湘帆，等．血友病的携带者与产前分子诊断[J]．中华检验医学杂志，2003，26(9)：540-542．
编辑：范伟伟
