李青1 李富荣2 吴雄文1
1.华中科技大学同济医学院免疫学教研室；2.暨南大学第二临床医学院临床医学研究中心
纳米又称为毫微米，是一种长度计量单位，1纳米等于十亿分之一米(1 nm=10-9 m)。纳米技术(Nanotechnology)是在0.1～100.0 nm空间尺度内操纵原子和分子，对材料进行加工制造后，产出具有特定功能的产品，或对某物质进行研究，掌握其原子和分子的运动规律和特性的一门崭新的综合性科学技术。科学家们发现，物质在加工到100 nm以下时，往往会产生许多既不同于微观的原子、分子，也不同于宏观世界的神奇变化，即产生表面效应、量子尺寸效应、宏观量子隧道效应，以及由这些效应引起的与传统材料所不同的奇异或反常的物理、化学特性。纳米技术涉及面十分广泛，已辐射多个学科。纳米技术在生物医学领域也得到了广泛的发展，虽然它还处于发展初期，但纳米医学作为一门新学科的时代已经到来。纳米技术已经对生物医学检测系统产生影响，其中不同形状、不同大小和不同成分的纳米微粒对生物医学检测水平也将产生根本的变化。而纳米微粒和生物分子轭合物的制备方法在不断更新，生物连接制备的纳米粒子也在逐渐商品化，亦将对检验医学同样产生深远影响。
一、磁性纳米粒
磁性纳米粒(magnetic nanopanicle)的研究始于80年代，迄今广泛用于有机固相合成和生物分子固定化的载体，其中磁性材料主要有Fe、Co、Ni 等过渡金属及其氧化物和混合材料等。磁性纳米粒具有超顺磁性，在外磁场作用下，固液相的分离十分简单，可省去离心、过滤等繁杂的操作，撤去磁场后无剩磁残留，并可在外磁场作用下定位。磁性纳米粒可通过共聚、表面改性赋予其表面多种反应性功能基，可连接各种基团或DNA片段而用于不同的检测。
1．生物活性物质和细胞的富集：在检验医学中被测活性物质或细胞的富集是一个重要问题，亲和配体技术在分选和回收方面提供了强有力的工具。批量磁性分离与传统的液相层析方法相比，具有速度快、样品无须预处理的优点。将单抗通过共价交联或吸附到磁性微粒的表面，形成具有免疫活性的磁性微球，免疫磁性微球(IMMS)表面的单抗能与相应的抗原(如细胞表面的抗原、微生物特异性的抗原及生物活性物质等)结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞或物质被吸附滞留在磁场中，而其他种类的细胞或物质则被分离，以达到富集的目的。免疫磁性微球将抗原抗体反应的高度特异性和纳米磁性微粒的富集作用相结合，可达到特异性的生物活性物质和细胞的富集效果，这种分离技术在临床医学诊断上具有广阔的应用前景。
Nagy等已用针对胎儿红细胞抗原，即运铁蛋白受体(CD71)单抗标记的免疫磁性微球很容易将母体外周血中的极少量胎儿细胞富集，方法简便，并能通过进一步荧光聚合酶链反应(PCR)检测确定胎儿性别，以进行非创伤性产前诊断。另外，癌症的早期诊断一直是医学界亟待解决的难题。理论上，利用免疫磁性微球进行细胞分离技术可在早期肿瘤患者血液中检出癌细胞，实现对肿瘤的早期诊断。Taubert等已用白细胞分化抗原(CD)45单抗标记的免疫磁性微球将外周血中的白细胞去除，从而实现癌细胞的富集，随后用免疫细胞化学方法检测癌细胞。如果将寡核苷酸链(dT)交联到纳米磁性微粒上，也可用于真核细胞poly(A)+mRNA的分离纯化。
2．生物活性物质和异生质分析与检测：生物活性物质的检测有很多种方法，其中，以抗体为基础的技术尤其重要。免疫分析加上磁性修饰已成功地用于各种生物活性物质和异生质(如药物、致癌物等)的检测。将特异性抗体或抗原固定到纳米磁球表面，并以酶、放射性同位素、荧光染料或化学发光物质为基础所产生的检测与传统微量滴定板技术相比具有简单、快速和灵敏的特点。比如Nam等建立了一种超灵敏的检测蛋白质的方法，在这个系统中使用了磁性微球[前列腺特异性抗原(PSA)单抗标记]和联有特异性DNA片段的纳米粒子(同时PSA单抗标记)2种试剂，通过夹心法与血清中的PSA形成复合物，在磁场下分离血清中的PSA，然后用PCR或基因芯片技术检测，其灵敏度比常规的临床检测方法高6个数量极。van Helden等将抗体连接的纳米磁性微球与高效率、快速的化学发光免疫测定技术相结合的自动检测系统，则成功地用于血清中人免疫缺陷病毒1型和2型(HIV-1和HIV-2)抗体的检测。另外，用于人胰岛素检测的全自动夹心法免疫测定技术也已建立，其中亦用到抗体-蛋白A-纳米磁性微粒复合物和碱性磷酸酶标记二抗。
二、纳米粒子
纳米粒子粒径很小，表面积大，偶联容量高，其悬浮稳定性较好，便于各种高效反应的进行，因此纳米粒子被用于各种不同的生物分析系统。纳米粒子作为一种试剂与传统的生物制剂相比较有很多优越性。
(一)纳米粒子作定量标签用于生物分析
将纳米粒子作为生物分析的标签是因为其可以代替有机荧光染料或放射性元素的标记，并克服了它们的缺点。主要的两个领域是量子点(quantum dot QD)和金属纳米粒子。
1．量子点：利用量子的限制作用，赋予纳米粒子独特的光学和电子的特性，又可称为半导体纳米微晶体。作为一种最新的荧光材料，量子点能够克服荧光分子重要的化学和光学局限性而具有多种特性，如具有多种颜色，而其颜色则取决于量子点的大小，在同一激发波长下，不同直径大小的量子点可发出不同颜色的激发光，达到同时检测多种指标的要求，这是染料分子根本无法实现的；其荧光时间较普通荧光分子延长数千倍)，同时也便于长期追踪和保存结果。量子点技术可用于检测活细胞里多种蛋白质活动，Jaiswal 等在量子点上包被一层dihydroxylipoic acid(DHLA)，使之易与亲和素连接，再针对不同的量子点给予不同的蛋白质抗体，制备出具有蛋白质专一性的一批量子点。此外，量子点还可与多种分子进行偶联(如蛋白A、抗体、链富亲和素等)作为荧光探针，检测特定的靶分子分布和功能。
2．金属纳米粒子：金属纳米粒子可用于多种检测途径，包括电化学、光学、显微学和质谱等。比如wang和同事将纳米金属粒子标记到寡核苷酸探针上，与样品中的目标DNA序列杂交，然后在金粒子上沉析出银，通过电势测定法检测目标序列。早期还有人将胶体金用于电子显微镜检测，如Csaki 用扫描隧道显微镜通过检测DNA的表面密度而用于目标序列的检测，在此系统中先将胶体金标记的寡核苷酸探针与被测DNA序列杂交，使目标序列带上胶体金标记的寡核苷酸链。zhang等则将电感耦合等离子体质谱测定法(inductively coupled plasma mass spectromeny，ICPMS)和夹心免疫测定法相结合建立了一种新的免疫检测方法。在这个系统中，他们将胶体金标记的羊抗兔抗体作为ICPMS的分析物间接检测兔抗人IgG。另外，这个系统还可通过在分析物上标记不同无机纳米粒，而达到同时检测不同物质的目的。
(二)纳米粒子作基质
被编码的纳米粒子能够作为基质用于液体内多样性的生物检测。与微点阵为基础的原理相比较，这种混悬液的检测具有更大的灵活性(即加入一种新的粒子即可多检测一项指标)、更快的速度、更大的重复性，使用更少的样品量和试剂等优点。将量子点作为基质与多聚物结合形成多聚物微珠，这种微珠可以携带几种不同尺寸(颜色)的量子点，其被照射后开始发光，经棱镜折射后产生几种指定密度的清晰线谱(条形码)，其标签数量可达到几十亿种。因此，其在条形码标记的基因芯片和蛋白质芯片技术中的应用具有广阔前景。同样，这些粒子的表面可以联上特异的寡核苷酸探针以识别特殊分子(定性)，同时将荧光染料直接标到寡核苷酸探针上(定量)，这样每种微珠上的荧光光谱就能够显示样品中目标序列的有无和多少。
(三)纳米粒子作信号的转导物
纳米粒子作为信号转导物可免去标记生物样品的需要，使其在检验诊断中显示出巨大的发展空间。同时，由于免去样品制备的步骤，使检验技术变得更简便和价廉。在这个系统中，纳米粒子之间相对位置的改变或纳米粒子对生物复合物的干扰作用都可作为一种检测信号。根据此原理，Thanh等研发了一种检测抗体浓度的方法，即抗原连接的金粒子发生聚集就能够检测抗体的浓度。Hirsch等建立了一种凝集反应检测血液中的免疫球蛋白方法。其他金属纳米粒子信号转导的应用，包括金纳米粒子介导的荧光淬灭，如Maxweu等利用胶体金纳米晶体能够淬灭荧光染料的特性，建立了辨别单个不匹配的寡核苷酸的检测方法。另外，在这个系统中开发了一种新型生物传感器，这种传感器的核为直径2.5nm 的金微粒，外面包裹一层寡核苷酸分子，该分子的一端为巯基，一端联有荧光分子，由于纳米金微粒是一种有效的能量受体，能够作为荧光的淬灭物，当这种传感器与样品中的目标分子杂交后，引起传感器构象的改变，导致淬灭的荧光分子复原。再则，由于此系统荧光背景极低，与传统的有机淬灭物相比，该类传感器具有独特的结构和光学特性。
(四)功能纳米粒子
纳米生物技术中令人兴奋的领域是使用纳米材料去执行粒子特殊的功能。换句话说，就是利用粒子内在物理或化学性质完成与分析相关的转换。Hamad-schifferil 等使用一个射频磁场热诱导吸附有金纳米粒子的DNA双链，使其加快去杂交。他们证明当温度升高10~20℃时，就可使DNA双链变性。同时他们还发现，2个DNA双链靠近时(1个带有金粒子，1个没有金粒子)，那么带有金粒子的DNA双链就能够选择性的被变性，而对另一个DNA双链无影响。最近，Paunesku等报道了一种新的TiO2-DNA纳米复合物，这种复合物具有光诱导核酸内切酶活性。Tkachencko 等则发现细胞核靶向的多功能金纳米粒子-肽复合物。在这种功能检测中，粒子必须小到能够进入细胞膜和核膜，并不被溶酶体吞噬破坏，还能携带靶向的多肽进行细胞核的
定位。
综上所述，纳米技术作为一门新兴学科被应用于医学领域，定将推动医学技术的进步与发展。含有纳米微粒的各种实验方法的广泛应用和纳米微粒在检验医学中的价值同现有技术相比，将极大提高检测方法的特异性、灵敏度和速度等性能。相信在不久的将来会有更多的新纳米材料出现，并被应用于新的检测方法中。
编辑：范伟伟
