浙江大学医学院附属儿童医院消化实验室 舒小莉 程海英 杨玲蓉 章许平 张雁翼 江米足
［摘要］ 目的 探讨幽门螺杆菌( HP) 抗体检测蛋白芯片技术在儿童HP 感染诊断中的应用价值。方法 本院经胃镜检查的120 例患儿，行快速尿素酶试验( RUT) 及组织切片Giemsa 染色。同时采用HP 抗体蛋白芯片检测患儿血清中抗CagA、抗VacA、抗Ure、抗Hsp60 及抗RdxA IgG 抗体。以RUT 及Giemsa 染色两项均阳性作为HP 感染阳性的诊断金标准。结果 120 例患儿中，确诊HP 感染阳性者60 例。Ure 抗体、Ure + CagA 抗体、Ure + VacA 抗体及Ure + CagA + VacA 抗体均阳性对HP 感染的诊断价值与金标准比较，吻合度和Kappa 一致性检验均有统计学意义( P<0.001) 。其中Ure + CagA 抗体诊断的敏感性为81.7%，特异性为91.7%，准确度为86.7%，阳性预测值为90.7%，阴性预测值为83.3%，诊断HP 现症感染最具临床价值。结论 HP 蛋白芯片抗体检测，特别是Ure 结合CagA 抗体检测，对诊断HP 感染有较高的临床价值，可作为HP 现症感染的诊断方法。
［关键词］ 幽门螺杆菌; 蛋白芯片技术; 尿素酶; 诊断; 儿童
幽门螺杆菌( Helicobacter pylori，HP) 是慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤及胃癌的主要致病因素，在我国有很高的感染率。儿童也属易感人群，可能是再发性腹痛的主要原因［1］。目前HP 的检测方法主要有侵入性和非侵入性方法［2-5］，但各种方法均存在利弊，因此，有必要寻求能进一步提高儿童HP 诊断依从性、适用性和准确性的方法。近年来，蛋白芯片技术也用于HP 感染的诊断，能实现对HP 多个指标的快速检测，便于HP的分型，有助于临床诊断、药物选择、预后判断和疗效跟踪［6-7］。据报道，HP 蛋白芯片技术稳定性好，检测的敏感性与特异性和ELISA 接近［6］，但其临床应用价值尚需进一步评估。本研究将蛋白芯片检测HP 感染与诊断金标准比较，评价蛋白芯片技术在儿童HP 感染诊断中的应用价值。
1 资料与方法
1．1 研究对象
选取2009 年9 月至2010 年3 月我院行胃镜检查的患儿120 例，其中男67 例，女53 例，年龄3 ～15岁，平均9.5 岁。均行胃黏膜活检标本快速尿素酶试验( RUT) 及组织切片Giemsa 染色，胃镜检查前常规采集血清-20℃保存待测。以RUT 及组织切片Giemsa 染色两项均阳性作为HP 感染阳性的诊断标准，两项均阴性者为HP 感染阴性。
1．2 蛋白芯片检测血清HP 抗体
HP 抗体检测蛋白芯片购自深圳欣康基因数码科技有限公司，取200 μL 患儿血清按说明书操作进行检测，抗体谱包括抗细胞毒素相关蛋白( CagA) 、抗空泡毒素相关蛋白( VacA) 、抗尿素酶( Ure) 、抗HP 热休克蛋白60( Hsp60) 及抗硝基还原酶( RdxA)IgG 抗体。蛋白芯片反应后在生物芯片阅读仪扫描，由该系统配备的Mara4.1 软件进行分析。
1．3 统计学分析
用四格表方法对蛋白芯片抗体检测诊断HP 感染的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值及阴性预测值进行评价，并采用SPSS 16.0 统计软件与HP 感染诊断金标准方法进行吻合度和Kappa 一致性检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2．1 蛋白芯片检测HP 抗体与HP 诊断金标准的比较
Ure 抗体、Ure + CagA 抗体、Ure + VacA 抗体或Ure + CagA + VacA 抗体均阳性对HP 感染的诊断价值与金标准比较，吻合度均有统计学意义( P<0.001) ，列联系数C 值依次为0.609、0.593、0.549、0.541 ( P<0.001) ; Kappa 一致性检验均有统计学意义，Kappa 系数依次为0.750、0.733、0.633、0.617 ( P<0.001) 。Ure 抗体阳性诊断HP感染敏感性为98.3%、特异性为76.7%、准确度为87.5%，阳性预测值为80.8%，阴性预测值为97.9%; Ure + CagA 抗体阳性诊断HP 感染敏感性为81.7%，特异性为91.7%，准确度为86.7%，阳性预测值为90.7%，阴性预测值为83.3%; Ure + VacA抗体阳性诊断HP 感染敏感性为68.3%、特异性为95.0%、准确度为81.7%; Ure + CagA + VacA 抗体阳性诊断HP 感染敏感性为66.7%、特异性为95.0%、准确度为80.8%。见表1 ～2。
2．2 HP 感染患儿中各抗体阳性率
胃黏膜RUT 和组织切片Giemsa 染色二项均阳性60 例患儿中，Ure 抗体阳性率98% ( 59 /60 ) ，CagA 抗体阳性率82% ( 49 /60) ，VacA 抗体阳性率68.3%( 41 /60) ，Hsp60 抗体阳性率10.0% ( 6 /60) ，RdxA 抗体阳性者28.3%( 17 /60) 。
3 讨论
HP 感染的致病机制较复杂，有毒力因子、细胞因子、自由基等多种致病因子参与。随着研究的深入，发现HP 在体内和体外的存活条件有很大区别［8］，一些在体内发挥毒力作用的蛋白可能在体外培养条件下完全不能表达，或者需要依赖体内的一些生理或病理刺激才能表达。因此抗体谱可能是真实反映宿主免疫反应对抗HP 的可靠指标［6，8］。
蛋白芯片技术是以蛋白质代替DNA 作为检测对象的一种方法［9］，HP 抗体蛋白芯片检测系统利用基因重组技术包被HP 的抗原，经微孔滤膜的渗滤、浓缩、凝集作用，使抗原抗体在固相膜上快速反应。目前蛋白芯片包被的HP 抗原主要有CagA、VacA、Ure、Hsp60 及RdxA 等5 种蛋白，可同时检测5 种抗体。CagA 具有很强的免疫原性，能诱导宿主胃黏膜局部产生多种细胞因子，进而通过促进中性粒细胞的聚集和活化启动炎症过程，与HP 毒力呈高度相关［10］。VacA 对胃上皮有直接的毒性作用，损伤上皮，使胞浆内空泡形成，损伤胃黏膜，延缓胃上皮的修复。近年的研究证实CagA 和VacA 是HP的主要毒力因子［11］。Ure 是HP 主要抗原之一，所有的野生型HP 均产生Ure，可引起患儿产生IgG 和IgA。热休克蛋白( Hsp) 家族成员通过促进自发的细胞增殖及抑制正常的细胞凋亡在肿瘤生长过程中起着重要作用［12］。HP 的Hsp60 作为一个黏附分子与胃上皮细胞及黏蛋白相互作用，同时它也是一个强有力的免疫原，能刺激宿主单核细胞、巨噬细胞及胃上皮细胞产生各种前炎症因子。新近的研究表明，HP 特有的Hsp60 可能通过释放各种前炎症因子、促进血管生成及转移从而触动癌变的发生［13］。Tanaka 等［14］的研究也提示Hsp60 与胃癌的发生发展关系极为密切。
一般认为，具有较高的特异性和准确度、敏感性又较高的诊断方法，比较具有临床诊断价值。本研究以胃镜活检黏膜RUT 和病理HP 诊断两项均阳性为HP 感染诊断金标准，HP 抗体检测蛋白芯片结果显示，诊断HP 感染敏感性较高的为Ure 抗体阳性或Ure + CagA 抗体均阳性，特异性较高的为Ure +CagA + VacA 抗体、Ure + VacA 抗体或Ure + CagA 抗体均阳性，准确度较高的为Ure 抗体阳性或Ure +CagA 抗体均阳性。本研究结果还显示，Ure 抗体、Ure + CagA 抗体、Ure + VacA 抗体或Ure + CagA +VacA 抗体均阳性对HP 感染的诊断吻合度与金标准比较均有统计学意义，提示符合率较高，但列联系数C 值以Ure 抗体阳性或Ure + CagA 抗体均阳性最高。Kappa 一致性检验也均有统计学意义，提示蛋白芯片测定结果与金标准诊断结果的一致性较好，但Kappa 系数以Ure 抗体阳性或Ure + CagA 抗体均阳性最高。提示蛋白芯片Ure 抗体阳性或Ure +CagA 抗体均阳性诊断HP 感染的价值高于Ure +VacA 抗体或Ure + CagA + VacA 抗体均阳性。由于Ure 抗体阳性诊断HP 感染的特异性较低，因而认为Ure 抗体和CagA 抗体两项均阳性诊断HP 现症感染最具临床价值。
HP 蛋白芯片检测还可进行菌株毒力性、耐药性及癌变风险因子检测，对临床治疗及预后评估具有重要意义。在西方国家，50% ～ 60% 的HP 临床分离株呈CagA 阳性，但在亚洲国家，如中国、日本及韩国，CagA 阳性菌株的比例都在90% 以上。本研究显示快速尿素酶试验、组织切片染色二项均阳性患儿中CagA 抗体阳性率达81． 7%，高于国内报道［7］，表明儿童感染的HP 菌株大部分毒力都较强。国外研究显示，含有RdxA 蛋白的菌株，对甲硝唑敏感，不含RdxA 的菌株则对甲硝唑有耐药性，而11%～70%的HP 临床分离株对甲硝唑耐药［15］，这一比例在我国更高［16］。本研究HP 感染患儿中RdxA 抗体阳性者为28.3%，表明71.7%( 43 /60) HP 感染患儿对甲硝唑耐药，提示选择药物时要注意耐药性问题。另外，本研究还发现，60 例患儿中有10% 的Hsp60 抗体阳性，由于Hsp60 抗体与肿瘤的密切关系，要引起高度重视，对其进行必要的随访和观察。
综上所述，蛋白芯片技术检测HP 抗体谱有一定的临床应用前景，其中Ure 抗体和CagA 抗体均阳性诊断HP 感染有较高的临床价值，可作为HP 现症感染的诊断方法。
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编辑：范伟伟
