随着医学科学的发展,全自动血凝仪人们对止血和血栓发生和发展的认识越来越深刻,止血和血栓的研究是一门新兴边缘学科,它涉及到临床多种疾病的发生和发展,并与临床治疗和预后有密切的关系,因此临床要求进行止血和血栓方面检查的样品和项目越来越多,这些检查项目广泛应用于出血、血栓性疾病及血栓前状态的诊断、疗效观察、抗凝药物剂量和预后分析。而传统的手工方法和单一的凝固定性检查已经远远不能满足临床要求;全自动血凝仪的应用,使得止血和血栓项目检查变得简便、准确,可做出多项精确的定量结果。
一、仪器的检测原理和基本方法
全自动血凝仪一般是使用生物学检测方法,也称为凝固法、还有免疫学方法及生物化学方法。目前血凝仪使用的生物学方法大致分成三类:电流法、粘度法、光学法。
1、电流法:该法是利用待检的血浆标本的纤维蛋白具有导电性,将电极插入标本中,利用两电极之间的电流的通、断来判断纤维蛋白是否形成,以此确定凝固终点。
2、粘度法:该法又称磁珠法;仪器的检测部分有独立的线圈产生所需的电磁场,检测时在待标本中加入小磁珠,利用变化的磁场使小磁珠产生运动,随着血浆的凝固,血浆粘稠度增加,小磁珠摆幅逐渐减少,仪器内的电磁传感器,测定小磁珠的不同振荡幅度,计算出血浆的凝固时间。
3、光学法:该法是目前血凝仪使用最多的一种检测方法。当血浆在样品杯中逐渐凝固时,纤维蛋白原转变成纤维蛋白,其理学性状也随着变化;当一束光通过样品杯时,其透射光和散射光的强度也会随之发生变化。所谓光学法就是血凝仪根据血液凝固而导致的光强度的变化,检测吸光度值(A)来判断血浆凝固终点的方法。
免疫学方法是以血浆中要检测的物质作为抗原,而试剂中带有相应的抗体,利用标本中的抗原和试剂中的抗体发生特异性结合反应,对标本中待测物质进行定量分析。凝血实验应用的免疫方法很多,如免疫电泳、免疫扩散法和免疫比浊法等。而全自动血凝仪一般采用免疫比浊法。免疫比浊法可分直接浊度分析和乳胶比浊。直接浊度分析有透射光比浊和散射光比浊两种。透射光比浊是指血凝仪光源部分产生的单色光通过待检血浆时,在标本中加入试剂后,抗原和抗体反应就会形成复合物颗粒,使得待检标本的浊度增加,则透过的光强度会减弱。光强度发生改变的程度与抗原的量成一定的数量关系,仪器中的电脑根据这种数量关系,控制将透射光强度变化值通过光电管转变成相应的电信号,并计算出抗原的精确数值。散射光比浊是指血凝仪光源的光通过待检标本时,抗原和抗体反应产生的复合物,其标本中产生较大的颗粒,光散射增强;散射光强度的变化与抗原成一定的数量关系,由这一关系,可准确求知标本中抗原的量。
乳胶比浊法是将血浆中要检测的物质相对应的抗体包被在直径为15-60nm的乳胶颗粒上,使得抗原和抗体复合物的体积增大,通过光源比浊时,透射光和散射光的强度值改变增大,提高检测的灵敏度。生物化学方法是通过测定产色物质的吸光度变化来推算所测定物质的含量;该法是以酶学方法为基础的直接定量法,对凝血、抗凝、纤溶系统各物质含量的测定结果准确、重复性好、并且所需样品量少。仪器使用的试剂是人工合成的某种活性酶裂解位点的化合物,且化合物连接上产色物质,待检血浆中含有活性酶,在检测过程中产色物质可被解离下来,使被检样品中出现颜色变化,仪器的光路系统根据此颜色变化检测出吸光度(A)的变化值,根据酶活性与吸光度值变化及所检测物质含量间的一定数量关系,计算电路可推算出被检标本某物质的含量。产色物质一般选用硝基苯胺(PNA);游离的PNA呈黄色。在405nm波长下PNA有特定的吸收峰;吸光度值变化最大;而其它物质在405nm波长时对光的吸收小于PNA的1%。
具体检测方法可采用终点法或动态法;终点法是在活性酶同产色物质作用一段时间后,加入乙酸终止反应,仪器检测此段时间的吸光度的变化,采集数据,计算出待测物质的含量。动态法就是连续采集样品吸光度变化值,由CPU电路计算出单位时间内吸光度的变化量,并以每分钟吸光度的变化来报告原始数据,通过换算得出所需的检验结果。全自动血凝仪一般采用动态法,其检测结果更加准确。如荷兰欧嘉隆科技公司生的Coag-A-MateMTX型全自动血凝仪就是采用生物化学方法进行检测;数据采集使用动态法。如血凝常规项目中的凝血酶原时间(PT)的测定,就是在待测血浆中加入过量的凝血因子Ⅲ和钙离子,使血浆发生体外凝固,在凝固过程中纤维蛋白原逐渐变成纤维蛋白,其理化性会发生改变,使得仪器透射光的强度也会发生改变,仪器CPU电路会自动根据光强度的变化来判断血浆凝固所需要的时间。还有一些仪器三种检测方法都具备,可根据需要随时转换,如CA6000型、MDA180型等;FUTURA型、MLA1600型、STA型全自动血凝仪具备凝固和产色两种检测方法。
二、仪器的构造简介
目前,血凝仪种类繁多,其构造也较复杂;全自动血凝仪一般是由主机、电脑、显示器和打印机组成;主机包括电路、光路、试剂、样品和检测系统,冲洗和排废液系统等部分。有些仪器采用架式取样器,更方便于随时追加标本和急诊标本的检测,如日本SYSMEX公司的CA-500系列和CA-6000等。
1、电脑和电路:有些仪器外接电脑,使用专用控制程序,通过数据电缆与机内的CPU电路板连接;有的则将电脑板装与仪器内,成为一体,均是通过总线接收和发送各种数据和状态信息,指挥各系统协调工作、控制多个步进电机、电磁阀、注射泵和废液泵转动及开闭,完成检测盘、样品盘的转动和监控等功能。
2、光路系统:仪器一般以卤素灯作为光源,光线通过滤光片后,变成单一波长的光;使用生物化学法,其检测波长选用405nm;采用比浊法时,其检测用单色光波长一般为575nm和800nm;有仪器根据检测项目自动选择。单一波长的光通过棱镜聚光后照射到待检标本上,然后照射到光电管上;光电管将光信号变成电信号,完成信号转换;电路部分将该信号进行放大、计算和处理得出检测结果。
3、样品、检测和试剂系统:仪器均具有样品盘或架式取样器,用于放置样品试管和质控血浆;试剂系统用于放置试剂。在电路控制和步进电机带动下,样品盘旋转,将要检测的试管转到探针位置,由探针吸取样品;探针安装在机械臂上;在电路和电机控制下,机械臂可做前后、左右、上下移动,带动探针到所需位置,完成自动加样品、试剂到检测盘反应杯内,并有自动稀释功能和探针自动冲洗功能。试剂系统有多个试剂位置,试剂系统一般具有冷藏功能,由控温电路控制,始终维持试剂系统恒温,保持试剂稳定。检测盘装有多个反应杯,在电路控制和步进电机带动下,匀速旋转通过光源,与检测通道相结合,完成数据采集。由控温电路控制检测盘始终处于37℃恒温中,以便样品和试剂反应稳定和完全。
三、仪器的数据采集和处理
免疫学分析采用比浊法,以血浆中的被检物质作为抗原,与试剂中的抗体混合时会发生特异性结合反应,产生复合物颗粒,依此来测定被检物质含量。血凝仪测定抗原含量基于两个原理:抗原量同抗原抗体特异性结合反应达到某一程度与所需的时间之间,存在一定的数量关系及抗原量同特异性结合反应速度之间存在一定的数据关系。在检测过程中,随着待检物质与相应抗体结合,其复合物颗粒增多,单色光通过时,透过的或反射的光强度就会发生一定的变化,仪器的电路部分自动算出单位时间内吸光度的变化量,再根据标准曲线推算出待检物质的含量。仪器在定标时自动制备标准曲线,其原理是:将抗原含量已知的标准品稀释成各种浓度,再检测各种浓度标准品的吸光度变化;以各稀释标准品的抗原浓度为横坐标,以其对应的吸光度变化值作纵坐标,得出标准曲线。仪器测得血浆加入试剂后吸光度的变化值,就可根据标准曲线算出血浆中待检物质的含量。
使用光学法检测时,一般是将预温好的待检血浆标本和试剂快速混合,在混合瞬间吸光度非常弱,随着样品和试剂混合物中的纤维蛋白凝块的形成,反应杯内标本吸光度逐渐增强,当标本凝固完全后,吸光度值就稳定下来;仪器在血浆和试剂混合的瞬间,也就是吸光度最弱时,设定吸光度值A=0%,在血浆的样品凝固完全后,吸光度最强时,设定吸光度值A=100%;在0%~100%吸光度变化之间,仪器检测通道单位时间内分别采集多个数据,这样吸光度的变化值可做出一条曲线,仪器根据实验项目需要自动选取曲线上的一点所对应的时间为凝固终点;因为凝血是一个酶促的加速过程,到凝固终点时,反应速度和加速度都达到最大,此时凝固曲线的二次微分为零。仪器在测定待测血浆样品前,必须首先定标,也是对己知浓度或活性的标准品的凝血时间进行测定,并以已知浓度或活性的血浆所对应的凝血时间来制定标准曲线;在检测待测样品时,计算电路首先检测出血浆的凝固时间,再根据凝固时间从标准曲线上求出浓度或活性。
四、全自动血凝仪的技术特点
1、检测速度快:单位时间内检测的标本数和完成的实验项目多。
2、检测方法多样:一般都具有生物法和生物化学法;有的仪器还具有免疫法。
3、仪器一般具有先进的程序控制和多光路检测,测定项目任意组合,随时追加标本和急症标本测定。结果有多种单位可供选择:秒、活性百分率、比值(RATIN)和国际标准化比率(INR)。
4、仪器一般具备系统自检功能:时刻监控各级系统工作状态,保证了无故障运转。
5、由于电脑功能较强,使得操作系统友好、软件灵活:提供科研程序供用户分析检验参数、扫描凝血和纤溶过程,可显示反应和定标曲线及凝固波形;可根据需要自行编程开发特殊检测。
6、双向通讯:可减少发报告时间;硬盘内能储存多个检测结果,可通过多种方式查询报告单。并能储存质控制记录、显示和打印质控制数据和质控图。
编辑：范伟伟
