徐华1, 韩金祥1 , 高雪芹1, 刘灿兰2, 李钿3, 黄海燕1, 潘继红1
(1 山东省医药生物技术研究中心, 国家卫生部生物技术药物重点实验室; 2 泰安市中心医院; 3 山东省立医院)
【摘要】目的 探讨蛋白芯片技术检测自身抗体的临床价值。方法 用酶联免疫吸附试验(ELISA )、蛋白芯片法检测抗dsDNA、抗Ro-60/SSA、抗Ro-52/SSA、抗SSB、抗Jo-1、抗磷脂IgG 抗体, 用间接免疫荧光法( IIF)、蛋白芯片法检测抗核抗体(ANA ) , 分别统计两种方法检测均阳性、均阴性和单阳性的标本数目, 并进行评价。结果 芯片法检测ANA 的灵敏度为89%、特异度为60% , 芯片法对其他6 种自身抗体检测的灵敏度为70. 0%～ 87. 5%、特异度为92. 7%～ 98. 9%。结论 蛋白芯片法检测自身抗体与常规方法比较, 特异度较高; 有待进一步改善技术提高其灵敏度。
【关键词】蛋白芯片; 自身免疫性疾病; 自身抗体; 间接免疫荧光法; 酶联免疫吸附实验
目前自身抗体的检测主要采用免疫学方法, 常用的有免疫印迹、免疫荧光、酶联免疫吸附试验(ELISA ) 及放射免疫法等, 但上述方法均需要相对大量的试剂和临床标本[ 1 ] , 且多次取血, 进行多种自身抗体的检测才能最终对疾病作出诊断。生物芯片/微阵列技术是一种高通量平行检测技术, 蛋白质和抗体微阵列已成为其研究工具[ 2 ] , 2005 年8 月～ 2006年2 月, 我们采用蛋白芯片技术检测了110 例自身免疫性疾病患者的7 种自身抗体, 并与常规检测方法进行比较。现报告如下。
1 材料与方法
1. 1 试剂与仪器 磨砂边玻片、盖玻片(美国Sigma公司) , 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES)、牛血清白蛋白(BSA )、人IgG、Cy3 荧光标记的羊抗人IgG 抗体、Ro-60/SSA、Ro-52/SSA、La/SSB、Jo-1、心磷脂(美国Sigma 公司) , 人成骨蛋白-7 (BMP-7)、核抗原、dsDNA (本实验室) ,ANA 筛查间接免疫荧光法检测试剂盒、抗ds-DNA 微孔板ELISA 检测试剂盒(德国欧蒙公司) , 抗L a/SSB、抗Jo-1 ELISA 检测试剂盒(美国IMMCO 公司) , 抗Ro52/SSA、抗Ro60/SSAELISA 检测试剂盒(德国BL-Diagnostika Gmbh 公司) , 抗磷脂抗体(APL ) IgG 检测试剂盒(美国INOVA 公司) , Cartisian 5500 点样仪, Scan Array 4000 激光共聚焦扫描仪。
1. 2 APES 修饰玻片的制备 APES 现用现配, 将洗净的玻片放入以1∶50 比例丙酮稀释的APES 中,停留20～30s, 取出稍停片刻, 再入纯丙酮溶液涮去未结合的APES, 晾干。
1. 3 标本 对照组为50 例健康供血员的血清标本(平均年龄27 岁) ; 观察组为110 例自身免疫性疾病患者的血清标本, 其中系统性红斑狼疮63 例, 干燥综合征22 例, 皮肌炎5 例, 系统性硬化症5 例, 类风湿关节炎13 例, 抗磷脂综合征1 例, 系统性血管炎1 例。
1. 4 检测方法
1. 4. 1 IIF 法及ELISA 法 用IIF 试剂盒对上述标本进行ANA 检测, 用ELISA 试剂盒对上述标本分别进行抗dsDNA、抗Ro-60/SSA、抗Ro-52/SSA、抗SSB、抗Jo-1 、APL IgG 抗体检测, 具体操作按照试剂盒说明书进行。
1. 4. 2 蛋白芯片法 蛋白芯片的制备: 分别取核抗原及dsDNA、Ro-60/SSA、Ro-52/SSA、La/SSB、Jo-1、心磷脂抗原, 浓度为100～1000ug/ml; 阳性对照为1mg/ml 的人IgG, 阴性对照选用本实验室自备的1mg/ml 的BMP-7, 空白对照为PBST (每升中含NaCl 8. 0g, KCl 0. 20g, Na2HPO4 1. 44g, KH2PO4 0. 24g, Tween-20 0. 1ml)。用Cartisian 5500 机器人点样仪点在APES 玻片上, 每个样品设4 个重复, 每张玻片8 个同样的阵列。
将制备好的芯片在37℃杂交盒中温孵2h; 封闭液(0. 01mol/L 、pH7. 4 的PBS, 含1%BSA 和2. 5% 蔗糖) 封闭30min, PBST 洗3 次, 每次15s; 每个阵列分别加入3ul 不同的标本血清, 37℃杂交15 min, PBST洗3 次, 方法同上; 每个阵列中加入3ul Cy3 标记的羊抗人IgG, 37℃温孵30 min, PBST 洗3 次, 方法同上;Scan Array 4000 扫描(扫描仪参数: Laser power 及DMT 均设定为80% ) , 图像存为TIEF 文件, 杂交点的荧光强度Quan tarray 对图像进行定量分析。
1. 5 结果判定 对每个用芯片法检测的血清标本数据进行分析, 计算出每个阵列中空白对照4 个重复点的平均值(X) 和标准差(S) , 得出95% 的参考值范围(X-2S, X+ 2S) ; 统计出每种抗体的4 个重复点荧光值的平均值, 此平均值高于X+ 2S 为阳性, 低于X-2S 则为阴性。IIF 法和ELISA 法检测结果按照说明书参考值范围确定阴性或阳性。以IIF 法和ELISA 法为标准, 对芯片法进行评价。
2 结果
上述方法分别对对照组行血清检测, 均为阴性,芯片检测与IIF 法和ELISA 法的阴性检测符合率为100%; 对于患者标本的检测, 除ANA 检测与IIF 法比较外, 其他抗体的检测都与ELISA 法比较, 分别统计两种方法检测均阳性、均阴性和单阳性的标本数目, 并进行评价, 见表1。
3 讨论
本实验中, 我们用自行制备的蛋白芯片对50 例健康人血清进行了检测, 结果均为阴性, 与IIF 法和ELISA 法的结果一致。蛋白芯片法对于ANA 的检测与IIF 法相比, 灵敏度为89% , 但特异度仅为60% , 考虑系两种方法所采用的底物不同所致。本实验中采用的核抗原为HEP-2 细胞提取物, 而IIF 法中采用的底物为鼠肝, 这两种底物中所含的抗原成分不会完全相同。ANA 是风湿病的筛选试验, 对于风湿病的鉴别诊断意义不大, 其他六种抗体对于风湿病的鉴别诊断意义较大, 蛋白芯片方法与目前比较认可的ELISA 法相比, 特异度较高, 灵敏度有待于通过改进芯片的技术方法进一步提高。
蛋白芯片技术检测自身抗体与现有常规技术相比, 快速、方便、高通量, 1～ 2h 内可同时检测多个抗体, 可以单人份检测, 也可以多人份同时检测, 同时价格也比较低廉, 适合患者需要, 是未来诊断的方向, 有必要进一步研究, 并在临床推广使用。
【参考文献】
[ 1 ] HueberW , U tz PJ , Steinman L , et al. Autoantibody profiling for the study and treatment of auto immune disease[J ]. Arth ritis Res, 2002, 4: 2902295.
[ 2 ] DufvaM , Christensen CB. Diagnostic and analytical app lications of protein microarrays[J ]. Expert Rev Proteomics, 2005, 2 (1) :41248.
编辑：范伟伟
