辽宁省血液中心 王芳, 金钊, 林松峰, 栾燕, 刘显智
[摘要] 目的:了解沈阳地区乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阴性献血者中乙型肝炎病毒( hepatitis B virus, HBV)感染状况,探讨HBV核酸扩增检测( nucleic acid amp lification testing,NAT)技术应用于血液筛查的意义。方法:在酶联免疫法( enzyme immunoassay, EIA)检测的基础上,应用TaqMan实时荧光聚合酶链式反应( PCR)方法对HBsAg EIA阴性血液标本进行HBV DNA的NAT检测。对NAT阳性标本进一步做乙型肝炎病毒血清标志物(HBV Marker, HBV-M)及核酸定量检测。结果:共检测了105, 152例HBsAg阴性的血液标本,检出HBV DNA阳性标本15例,阳性率0.014%。Abbott酶联免疫试剂检测发现, 15例标本中有6例标本的HBV - M五项指标检测全部阴性, 9例为HBsAg阴性但其它标志物阳性。其中10例HBV DNA阳性标本再经Roche试剂进行核酸定量检测, HBV DNA核酸含量最高为149 IU /ml。结论:在HBsAg ELA阴性献血者中仍有极少数的HBV感染者;核酸扩增检测和酶联免疫检测互补,能够缩短血液筛查中HBV检测窗口期,特别是对提高HBsAg阴性血液标本中HBV感染检出率具有重要价值。
[关键词] 核酸扩增检测; 实时荧光量PCR;乙型肝炎病毒DNA;窗口期
输血作为一种重要的治疗手段挽救了无数病人的生命,但同时也会因为输血不安全对病人造成严重的危害。因此,输血安全已经成为全球关注的医学焦点问题[ 1 ]。随着献血者筛选程序的改进以及病毒血清学检测方法灵敏度的提高,经输血传播乙型肝炎病毒的几率已经大为降低。但是,由于病毒感染血液后的血清转换窗口期(window period,WP)以及病毒变异与免疫静默等,都可造成酶联免疫法检测HBsAg的漏检,因此输血或输注血液制品仍有一定的传播HBV的残余风险。核酸扩增检测可以和酶联免疫检测形成互补,有效提高病毒感染血液窗口期的检出率[ 2 ] ,进一步降低经输血传播病毒的风险[ 3～5 ] ,在欧美及亚洲一些国家已经得到了普遍的应用。随着我国国民经济的发展及人民生活水平的提高,国内尝试开展核酸检测的采供血机构也已经越来越多。辽宁省血液中心自2008年8月在无偿献血者血液筛查中引入核酸检测技术,在探讨现行临床用血HBV DNA感染状况的同时,为核酸检测常规化、集中化检测积累实验数据,提供科学的应用依据。
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂
Microlab FAME 全自动酶免分析仪(瑞士Hamilton ) ;EZBead System - 32核酸提取仪;Mx3000P ( Stratagene)实时荧光定量检测系统; HBsAg ELISA试剂(北京万泰生物药业股份有限公司, 批号: B20080305、B20081124、B20090202;上海科华生物工程股份有限公司, 批号20080319、20081119、200903025) ; HBV-m试剂(Abbott Murex Biotech Limited,乙肝表面抗原(HBsAg)批号: 80335LF00,乙肝表面抗体(HBsAb)批号75684M100,乙肝e抗原(HBeAg)批号79315HN00,乙肝e抗体(HBeAb)批号78674HN00,乙肝核心抗体(HBcAb)批号72448M100) ; HBV DNA核酸筛查试剂(上海浩源生物科技有限公司,批号20080701、20090961) ; HBV DNA核酸定量试剂(Roche COBAS TaqMan HBV Test,批号M02701) 。
1.2 标本及信息储存
HBsAg阴性血清标本105, 152例,采自沈阳地区无偿献血者,标本无添加剂,采集后2℃～8℃保存, 24 h 内分离血清,EIA阴性NAT阳性标本- 80℃保存。扫描仪记录并储存标本条码信息以备追溯。
1.3 HBV核酸筛查
1.3.1 HBV核酸提取 取血清标本200μl,采用磁珠法在EZbead System - 32自动核酸提取仪上进行核酸提取。提取的核酸洗脱在100μl 洗脱液中,作为扩增模板。
1.3.2 HBV核酸扩增 取25μl核酸模板,加入15μl含有HBV特异引物、探针、Taq酶等的PCR反应液,按下列步骤扩增: 50℃ 2 min, 94℃ 3 min;然后按94℃ 10 s、50℃ 10 s、65℃ 35 s,重复45个循环。Mx3000P实时荧光定量检测系统自动判读分析结果。以WHO标准品界定试剂的检测限。
1.3.3 质量控制 严格按照上海浩源生物科技有限公司的HBV DNA核酸筛查试剂盒说明书操作。对整个实验过程设置阳性对照、阴性对照和内对照进行监控。
1.4 HBV核酸阳性标本的追踪检测
对于HBV DNA 阳性的标本采用Abbott酶免试剂检测HBV-M,并用Roche COBAS TaqMan HBV Test试剂盒进行了HBV DNA定量检测。
2 结果
2.1 HBV DNA核酸筛查试剂灵敏度测定
将WHO 97 /750 HBV DNA (1.0 ×106 IU /ml)标准品用阴性血清系列稀释,每一稀释度样本平行测定16例,结果见表1。经Probit统计学分析,核酸检测试剂对HBV DNA95%的检测限为20.85 IU /ml。
2.2 核酸筛查结果
共检测了105, 152例HBsAg EIA阴性的无偿献血者血清标本,检出HBV DNA阳性标本15例。
2.3 HBV DNA阳性标本的HBV-M检测
为了验证核酸筛查结果的可靠性,对HBV DNA筛查阳性的15例标本采用Abbott酶免试剂进行HBV - M五项指标检测。结果显示, 15 例标本HBsAg均为阴性, 其中6 例标本HBV - M均阴性,另外9例标本HBV - M其它标志物阳性,应属HBV感染漏检。值得注意的是其中4例标本为HBsAb阳性,且11号标本的HBsAb滴度高达485.22 m IU /ml,提示该4例标本可能存在HBV基因组S区变异。详细结果见表2。
2.4 HBV DNA阳性标本核酸定量检测
由于部分标本的量不足,我们只将其中10例HBV DNA阳性标本用Roche COBAS TaqMan HBV Test试剂盒进行了定量检测。结果显示10例标本HBV DNA均检出,其中3例标本定量结果< 6 IU /ml,另外7例标本HBV DNA含量在21.3～149 IU /ml之间,详细结果见表3。
3 讨论
目前,世界上很多国家均开展了NAT血液筛查项目,筛查内容主要包括HBV DNA、HCV RNA、HIV-1 RNA等,旨在提高用血安全,降低输血感染率[ 6 ] 。我们使用TaqMan实时荧光定性技术,从105, 152例HBsAg阴性的无偿献血者血液标本中检出HBV DNA 阳性标本15 例,阳性率0.014%。经过与Roche核酸定量试剂检测的结果对比,表明我们所采用的国产HBV DNA筛查试剂已基本达到Roche COBAS TaqMan定量试剂的灵敏度。
实验数据显示,经EIA检测HBsAg阴性无偿献血者血液标本的HBV DNA 阳性漏检率0.014% ( 15 /105, 152) 。6 例HBV - M五项指标阴性而HBV DNA阳性标本中,有2例(3、12号标本)在1个月后的随访中发现HBsAg转阳,为典型窗口期感染标本(结果另文发表) 。其余4例未追踪到的HBV -M阴性标本经Roche核酸定量试剂检测,除1例(8号标本)浓度小于6 IU /ml,另外3例(10、13、15号标本)分别为123、21.3和95 IU /ml,亦不能排除HBV感染窗口期的可能性。这些窗口期标本的检出,表明NAT检测在无偿献血者血液标本筛查中有着重要的意义。
除上述6例HBV - M五项指标阴性标本之外,其它9例标本均为HBsAg阴性,但有4例标本为HBsAb阳性,且11号标本的HBsAb滴度高达485.22 m IU /ml,提示可能存在HBV基因组S区变异。因这些HBV标志物尚未列入目前的血液筛查检测范围,也是造成HBV漏检的原因之一。HBV DNA核酸筛查正好可以弥补这方面的缺陷并与E IA检测形成互补。
本次研究主要针对沈阳地区无偿献血者血液标本,在HBsAg EIA检测阴性的基础上引入NAT检测。通过对105, 152例HBsAg阴性标本的NAT检测,共检测出HBV DNA阳性15例,阳性率0.014% ,提示目前临床用血仍然存在一定的风险,而核酸扩增检测和酶联免疫检测互补,对于缩短血液筛查中HBV检测窗口期和提高HBsAg阴性血液标本中HBV感染检出率具有重要价值。
[参考文献]
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[ 2 ] 李执如, Jork C, Schottstedt V,等.德国红十字捐血机构病毒核酸筛查经验: 3千多万例捐血的HIV-1 HCV和HBV病毒核酸筛查结果[ J ]1国际输血及血液学杂志, 2009, 32 (2) : 184 - 186.
[ 3 ] 曾劲峰, 叶贤林, 马兰,等.血筛用酶联免疫吸附试验与核酸检测互补性探讨和研究[ J ].国际检测医学杂志, 2008, 29 ( 8) : 683 -686.
[ 4 ] 黄呈辉,黄建国,欧阳玲,等.应用核酸扩增技术对血液中HBV、HCV和HIV-1检测[ J ].中国输血杂志, 2005, 18 (3) : 202 - 204.
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[ 6 ] Susan L, Stramer.Current risks of transfusion - transmitted agents: A review [ J ]1Arch Pathol LabMed, 2007, 131: 702 - 707.
编辑：范伟伟
