上海大学， 上海生物医学工程研究所 刘印锋 葛华勇 王保华
内容提要：显微镜是一种重要的医学仪器，它极大的促进了医学的发展。显微图像广泛用于诊断，但传统的分析方法有许多的不足。随着计算机和图像处理技术的发展，计算机开始被用于显微图像的分析。这种方法极大地提高了检测者的效率减轻了工作中的压力。本文对显微图像的分析及处理技术做了一些介绍，主要包括图像采集，图像分割，特征提取等。
关键字：显微图像 图像采集 图像分析 图像分割 特征提取
引言
显微镜是一种重要的光学仪器，它通过光学系统使被观察的对象得到放大，使人们从微观形态来认识和研究对象的特性。显微镜的出现，使医学研究达到了细胞的水平，对医学的进步起到了巨大的推动作用。
显微图像在医学上的应用非常广泛，主要有以下几个方面：病理学、临床诊断、遗传基因、免疫学等。利用病理组织切片的显微图像可以观察病理组织的病变的情况；利用血液涂片及各种体液涂片的显微图像可以观察人体内各种细胞、病原微生物的状况，以及其中的许多重要成分的分布情况，从而为临床诊断提供直观形象的依据。
显微图像为医生的诊断提供了强有力的手段，但随着新的临床检验仪器的出现，作为一种检测手段它的不足也越来越明显。主要表现在：
(1) 传统的医学显微图像的分析是在光学显微镜下由检测人员直接观看，对照显微例图样本做出分析和判断，给出诊断结论。检测的结果是以文字方式记录下来的，不利于主治医师和住院部医师对显微图像做进一步分析。无法适应医院信息化发展的趋势。
(2) 由于对显微图像的分析主要是人工目测分析完成的，这就需要检测人员具有非常丰富的经验。同时存在效率低、工作强度大，操作人员易疲劳，人为误差不可避免(等缺点)。在分析大量图像时，会产生自适应现象，人工识别的持久性、稳定性和客观性往往难以保证，长期的镜下观察会对检测人员的健康造成损害。
采用计算机的图像处理技术取代人工的显微图像分析早在20 世纪70 年代就已经有人提出，但是，由于当时计算机软硬件发展水平和识别算法的限制，上述方法未能实现。在信息技术高速发展的今天，随着计算机及数字图像处理技术的飞速发展，显微图像的数字化技术为医学显微图像的应用带来了新的发展机遇。
1 显微图像数字化
图像数字化技术在医学上的应用发展迅速，这在医学影像学诊断领域得到了有力的验证。近年来，随着高分辨率摄像器件、计算机技术的发展，显微图像数字化技术也开始应用于医学诊断。利用现代光电转换技术、及相应的计算机软硬件的结合，实现光学显微图像的数字化。将难以观测的显微镜视场光学图像，变成在计算机屏幕上的大面积、高亮度、真彩色数字化图像已经成为计算机分析处理的必要前提。
显微图像的数字化就是将视场中的图像转变为数字图像的图像采集过程。在光学显微镜中，显微镜的光学系统将玻片样品形成的放大的像，进入CCD，然后投射到CCD器件的接受面上，将光强分布不同的光学显微图像转换成相应的电荷分布不同的“电像”，通过适当的图像采集卡，将这种“电像”模拟信号，作数字化变换和适当处理以后，输入计算机即可获得可见的数字化的显
微图像。原理如图1 所示：
CCD 器件的性能将会直接影响到数字化后的显微图像的质量。CCD技术发展的速度非常快，由10 多年前线阵CCD[1]发展为当前分辨率非常高的面阵CCD。不同的显微图像对CCD的技术要求是不一样的，例如医用常规血细胞、组织切片显微图像分辨率有380线就可以了，对于人类染色体图像分析系统和精子运动参数其分辨率要达到600线左右，而对于单个活细胞实时检测，要求CCD 的分辨率更高，同时对灵敏度也有很高的要求。
图像采集卡将来自CCD摄像器件的模拟视频信号转化为数字信号，是输入计算机的关键部件。图像采集卡的性能直接影响到形成的数字图像的质量和图像的后处理。图像采集卡的选择跟所选用的CCD器件的分辨率有关，还与单位时间内采集的图像的帧数有关。采集卡应用比较广泛但其接口不灵活，不能做到即插即用，图像处理的过程比较复杂，容易对图像的质量产生影响。
随着USB技术的快速发展，USB的传输速度也越来越快，使用起来可靠性比较高。只要有软件的支持，同一个USB设备就可以在任何一种计算机体系中使用，可以作为主机和医学仪器之间的通信接口。可以采用具有USB 接口的CCD器件，利用USB传输线和USB 接口来实现数字图像的传输，这种处理方式可靠性高，过程相对简单，已经成为图像采集发展的一个方向。原理如图2 所示：
计算机可以采集显微镜中实时观察到的显微图像，检测员可以在计算机上对显微图像进行分析，而且还可对屏幕上的图像作各种处理并可随时存贮或复现，提高了效率和临床诊断的准确性，促进了医院的信息化的进程，使之成为医院信息化系统的一个组成部分。现在已经有许多显微图像分析系统的产品出现，如图3所示。
2 显微图像的分析处理技术
显微图像的分析系统是在显微图像数字化的基础上，来分析显微图像中的相关参数。利用计算机对显微图像作各种处理，加快了分析处理的速度，突出人们所需要的信息。显微图像分析技术使组织形态的分析，从传统的定性观察转变为定量分析。对细胞数量、形态分析由人工统计转变为计算机的自动分析，计数，并能提取诸多形态学待征及密度参数，进行多种参数的测量。极大提高了显微图像分析的精确度。为临床诊断和医学研究提供了定量、准确、迅速的诊断手段。图4 为一个显微细胞分析系统的界面。
显微图像的种类比较多，不同的图像内容差别比较明显，因此很难设计一种通用的图像分析系统。现在大部分图像分析系统都是针对具体的显微图像。虽然具体的分析系统并不一样，但分析的方法基本是相似的。基本包括系统控制（聚焦）、图像采集，图像预处理（平滑，分割，去噪），图像分析几个部分[7]。原理如图5 所示。
涉及到的处理技术主要包括聚焦、分割、提取特征以及分析识别几个部分：
2.1 自动聚焦
在获得显微图像的过程中，显微镜的聚焦是非常重要的。手动聚焦劳动强度比较大，易产生误差。采用自动聚焦是分析系统发展的趋势。
显微镜的自动聚焦技术主要是通过各种光电检测法，得到离焦信息，然后反馈给控制系统，系统根据离焦信息，通过步进电机调节显微镜的物镜及载物台之间的距离，通过不断的检测，反馈，调节，直到最终达到聚焦。早期的自动聚焦技术[2]有些是采用事先调好焦距，记录下相应的参数，然后对于同类型的玻片在聚焦的过程中，利用前面记录的参数来控制聚焦。但这种方法精度不高，易受人为因素的影响。现在普遍采用以数字图像处理和分析为基础的自动聚焦方法，通过图像的清晰度得到有关的参数，PC机将控制指令字发到串行口，单片机读取指令，获得相应的控制指令，驱动步进电机控制显微镜载物台运动。聚焦技术的关键就是聚焦判别函数的选择，当前的算法比较多，主要有：图像边沿检测算法、图像标准差法、灰度差分绝对值和法以及图像最大化法，实验证明，最大化法具有普适性，速度快，聚焦灵敏度比较高的特性。对于聚焦判别函数的选择必须注意函数的形状和计算量。
2.2 图像分割
图像中的同一区域的像素有相同或相似的属性，不同区域的像素属性不同。要对图像中感兴趣的区域进行处理和分析，就必须把感兴趣的区域从图像中分割出来，同时对图像进行分割时应根据图像的特点自动实现。图像分割就是从复杂图像场景中分离出感兴趣目标，是显微图像中细胞信息提取、分析与定量研究的关键。显微图像分割一般利用生物细胞图像特有的统计特性、图像中细胞及细胞质的轮廓、边缘和纹理等视觉特性进行分割，图像分割的方法比较多，传统的分割方法按基本原理大致可以分为3 类：一是基于灰度特征的阈值分割法，此类方法主要根据图像的灰度统计特征，通过约束函数，选择合适的阈值进行图像分割；二是基于边界提取、边界检测的分割技术，这类方法的基本思想是利用图像的局部灰度梯度变化情况确定目标和背景之间的边界，将其连接成闭合的区域，然后对图像进行分割；三是基于区域的分割方法，常见的有区域增长分割方法[9][10]和区域分裂、聚合分割算法，该算法适用于有复杂场景或自然景物等类似先验知识不足的图像。显微图像相对于一般的图像而言有其特殊的地方，很多涂片的显微图像背景一般比较均匀，图像的色彩变化及直方图的形状相对比较单一，病理切片的显微图像中的目标相对一般比较小，背景较复杂，存在比较明显的干扰现象。目前采用比较多是第一类方法利用阈值进行分割，它一般针对于各种涂片的显微图像，而病理切片的显微图像由于图像比较复杂，可以采用边界分割和区域增长的方法进行处理。
近些年来，数学各分支在理论和应用上的迅速发展，使得小波变换、分形理论、数学形态学、遗传学算法等在显微图像分割中取得很大进展，产生了不少新的分割算法。例如：基于小波变换的分割算法，基于数学形态学的分割算法，基于遗传算法的分割方法，基于神经网络分割算法等一些新的算法[8][11]。
不同的显微图像之间的差别比较大，目标区域的比重及目标区域的复杂程度各不相同，很难得到统一的显微图像自动分割算法。任何一种显微图像分割方法，都应该在结合图像本身的统计特性、边缘特性、生化属性、形态特征等各种特性基础上选择合适分割方法。
2.3 特征提取及选择
显微图像的处理和分析系统的原理就是提取目标或感兴趣区域的特征进而实现对目标的分析或进一步的识别。特征提取及特征优化选择是模式识别的重要环节[9]，是进行分类的依据，同时也是对目标进行分析的主要内容。为了有效地实现分类识别，就要对提取的特征进行比较，并得到最能反映分类本质的特征，这就是特征的选择。在识别的过程中应根据具体的图像选择不同的特征。特征选择后应对选择的特征进行计算、学习、作标准化处理、获取相关性比较小的可靠的分类能力强的特征向量。然后利用所得到的样本来训练分类器，就可以得到基于所选特征的判决函数。
对显微图像进行处理时，因为不同种类的显微图像所包含的目标或感兴趣区域是不相同的。因此在提取特征进行分析时，用到的特征也各不相同。一般应该在从事显微图像检测的专业人士的指导下进行。对于显微图像中的细胞来说识别的特征基本包括形状、颜色、光密度、纹理等几类性质不同的特征[3]，每一类特征里面又会有许多种反映细胞不同部分或不同部分之间的特征。
2.4 分析识别
对目标进行识别的方法比较多，主要有模板匹配的方法，统计模式识别的方法，结构模式识别的方法以及人工神经网络分类的方法[6][7]。
模板匹配使用目标的图像与存储的模板项比较，根据相似程度来对目标进行分类。模板匹配法的应用有其限制，要表明诸物体的各种方向及尺寸，匹配过程所需的存储量和计算量都是很可观的。故模板匹配法适宜作少数几种局部特征变化不大的检测，如人脸，指纹等。统计模式识别的方法是研究每一个模板的各种测量数据统计特性，依照统计决策理论来进行分类，主要有特征处理和分类两个部分，它适合于图像不是很复杂，类别较少的情况。结构模式识别是将一个复杂的模式分解成一系列更简单的模式，继续分解直到得到最简单的子模式，然后借助于一种形式语言对模式的结构进行描述，从而识别图像。对于识别多类，多特征的图像效果较好。神经网络分类的模式识别过程中，输入的是未知对象的特征向量，通过一个附加的权重和偏移，经过某种函数的变换，产生一个信息，在经过不同层的传播使输出层上产生相应的输出向量，根据输出的结果就可以将该对象进行分类。神经网络适用于对问题了解比较少的情况，可以实现特征空间较复杂的划分。
当前在显微图像识别方面用得比较多的是后3 种。根据分类目标的不同，有些方法也可以交叉使用。分类比较少的时候，例如分成两类，可以采用统计模式识别的方法。如果分的种类比较多时可采用结构模式识别[4]或神经网络[5]的方法。完成一幅图像的识别一般要经过许多不同的处理过程，图像的识别正是这些过程综合作用的结果。在实现的过程中具体采用哪一种方法，应该根据显微图像识别的种类及显微图像中相应细胞的先验知识的多少来选择具体的分类算法。
3 结束语
数字图像处理技术在生物医学领域中的应用越来越广泛，这是现代医学与计算机图像处理技术发展的必然结果。目前显微图像的分析处理技术已经广泛应用于病理诊断学、细胞生物学、组织胚胎学、遗传免疫学等学科，并且正向着标准化、自动化的方向发展。
参考文献
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编辑：范伟伟
