王惠芳1 ,2 ,陆慧君1 ,贺文琦1 ,刘立国1 ,张素阁2 ,邓旭亮3
(1. 吉林大学畜牧兽医学院 ; 2. 济南军区总医院 ; 3. 北京大学口腔医院口腔医学院)
摘 要:白色念珠菌是一种致病性酵母真菌,可引起人畜口腔、上呼吸道、阴道黏膜及全身性感染。随着抗真菌药物的长期大量使用,真菌的耐药性越来越严重。临床调查结果表明,白色念珠菌感染在真菌感染病例中跃居第2 位。正确鉴定与分类有利于对白色念珠菌感染进行及时诊断、预防和治疗。文章主要对白色念珠菌的分子生物学分型方法进行综述。
关键词:白色念珠菌;分型;随机扩增多态性DNA 技术
念珠菌属( Genus Candida) 包括大约150 种不产生芽孢的酵母菌种属,现已命名的有81 种。由于它们没有能力形成有性生殖阶段,所以属于真菌超纲( Eumycetes) 、不全菌纲(Deuteromycetes or fungiimperfecti) 、隐球菌科( Family cryptococcaceae ) 。对人类有致病作用的有11 种念珠菌,包括白色念珠菌( C. albicans) 、热带念珠菌( C. tropicalis) 、近平滑念珠菌( C. parapsilosis) 、星形念珠菌( C. stellatoidea) 等[1 ] 。其中,白色念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌是经常从医学标本中分离出来的3 个菌种,白色念珠菌的致病力最强。而在医院临床感染的致病菌中,白色念珠菌感染已跃居第4位[2 ] 。
对白色念珠菌感染进行正确的诊断、有效的治疗及预防,首先需要可靠的菌种鉴定分类方法,特别是菌株间关系的分析判断,对确定传染源和传播途径十分重要。由于致病真菌的变异性和复杂性,仅靠传统方法往往不能达到对其快速准确鉴定的目的。传统的真菌鉴定需经历形态学、生化试验、免疫学鉴定等阶段。现已进入分子生物学鉴定时代,如何利用分子生物学技术,对我国常见的病原真菌菌种进行快速、特异、简便地鉴定,是亟待解决的重要课题。目前在病原真菌研究领域,分子流行病学方面的研究十分活跃。PCR 相关的一系列技术已广泛应用于微生物的分型、鉴定及其亲缘关系的研究。作者就目前用于白色念珠菌基因分型的分子生物学方法做一综述。
1 随机扩增多态性DNA 技术
随机扩增多态性DNA ( random amplified polymorphic DNA , RAPD) 技术是一项揭示基因组DNA 多态性的新技术[3~4 ] ,其原理是采用随机的十聚寡核苷酸序列为引物,这种引物不属于已知遗传位点,它能通过PCR 介导所有与其互补的基因区段进行扩增,产生一系列大小不同的片段,并通过琼脂糖凝胶电泳而呈现出特征性的DNA 指纹图。其方法简便灵敏,只需极少量的基因组DNA ,并且DNA少量降解对试验结果不会产生负面影响,因而省时省力;RAPD 技术利用随机引物对DNA 基因组进行遗传信息检测,这和RFLP ( rest riction fragment length polymorp hism) 、SSR ( simple sequence repeat) 等分子标记技术相比较,减少了引物的设计过程,便于展开检测工作,而且,随机引物是人工定序合成的,可以批量生产,降低试验成本; RAPD 技术无需借助于有危害性的放射性同位素,避免了对操作人员的危害。由于RAPD 扩增所用引物序列短(10 bp) 和复性温度低(一般在30 ℃～40 ℃之间) ,因而扩增结果受多种因素的影响,如DNA 用量、Mg2+ 浓度、引物和Taq DNA 聚合酶的质量和浓度,以及变性、退火、延伸温度和反应时间、热循环次数,甚至不同PCR 扩增仪和实验中的人为因素等,都会影响RAPD 指纹图谱条带的数目、强度和重复性。所以,必须对RAPD 反应条件和影响因素逐一进行筛选,建立优化反应体系,以获得较稳定的试验结果。
近年来,随着PCR 技术在临床上的大量应用,RAPD 技术也越来越受到重视,特别是作为简单、快速、有效的分型方法在细菌、真菌、支原体、螺旋体等微生物中得到广泛应用。Giammanco GM 等[ 5 ] 通过菌落的形态学特征对临床分离的白色念珠菌进行培养,可以看到有11 种不同的形态,而RAPD 指纹分析有25 种不同的模型,CHEF (contour clamped homogeneous electric field) 电泳可识别9 种不同的核型。由此可见,RAPD 用在白色念珠菌分型上更精确。运用RAPD 技术对从念珠菌血症患者分离的13 株念珠菌进行分型,发现其中10 株是白色念珠菌,2 株是光滑念珠菌,1 株是近平滑念珠菌。表明该方法得到进一步应用[6 ] 。
2 限制性片段长度多态性分析
限制性片段长度多态性分析(RFLP) 技术是指用限制性内切酶酶切不同的个体基因组DNA 后含有同源序列的酶切片段在长度上的差异。这种方法比较直接,提取DNA 后用合适的内切酶切割,凝胶电泳分离片段,根据条带的位置和深浅来确定不同的菌株。RFLP 方法的缺点是,如果产生的片段太少,区分能力就不够;而产生的片段过多,有的片段可能因为太小显示不清楚。对于细菌来讲,DNA 中没有很多的重复片段,复杂性要小得多,所得到的图谱可以比较准确的确定。白色念珠菌产生的条带要复杂的多,对图谱中染色浅的条带很难进行分析。免疫印迹结合特异的探针杂交,使特异的片段染色,可以提高区分效能。利用DNA 的重复序列制备探针,可以产生足够复杂的杂交图谱,从而有足够的敏感性和准确性鉴定临床分离株之间的关系。对白色念珠菌来说,目前最常用的探针是27A 和Ca3 两种[7 ] ,都含有白色念珠菌的重复序列RPS。Ca3 要长一些(11 kb) ,比27A (6. 7 kb) 多含有一个重复序列,前者产生的杂交图谱要更复杂一些,区分能力也更强一些,目前该探针被广泛应用。
Michael J 等[8 ] 设计了3 组引物,分别对白色念珠菌的3 个区段进行扩增分析,第1 组引物可以将D 组白色念珠菌区分出来,但这一组引物不能区分其他白色念珠菌;第2 组引物,可以将上一组区分不出来的各组区分开。第3 组引物,通过其扩增的片段大小,将白色念珠菌分成4 组,即A 组(约450bp) 、B 组(840 bp) 、C 组(450 bp 和840 bp) 和D 组(1080 bp) 。第3 组引物成为一种比较好的区分白色念珠菌的方法,具有操作简单,结果容易鉴别的特点。Tamura M 等[9 ] 用这种方法又发现了一种新的基因型E 组(1400 bp) ,进一步证明了这种方法的有效性。利用该技术很容易地区分表型非常相近的白色念珠菌和都柏林念珠菌,用Bln Ⅰ酶一次即可切开都柏林念珠菌的ITS 区,而白色念珠菌ITS 区不能切开,所有受试标准菌株用该法可以准确鉴别,对临床分离的140 株从形态学上鉴定为白色念珠菌,用PCR-RFLP 方法得到验证[10 ] 。
3 电泳核型
白色念珠菌的基因组分子质量巨大(33 Mb) ,用通常的酶切办法,产生的DNA 片段过大,一般的电泳方法不能将其分开。20 世纪80 年代产生了脉冲场电泳技术(PFGE) ,原理是电场的方向不断的有规律的变化,从而推动DNA 片段在凝胶中迂回前进,达到了分离的目的。当前, PFGE 已经成功的运用到白色念珠菌和其他多种致病性真菌的染色体分离、基因图谱构建和电泳核型分型。运用这一技术获得的惊人发现,不同白色念珠菌分离菌株的电泳核型存在着很大的差异。Wilson MJ 等[11 ] 用电泳核酸技术和1R-PCR 技术进行了分子流行病学的研究。从14 例患者中共分离出了43 株白色念珠菌。PFGE 的缺点是需要特殊的仪器设备,技术要求高,电泳时间长(一般72 h) ,容易受到干扰因素的影响。
4 单链构象多态性分析
建立在PCR 基础上的单链构象多态性分析( singlest rand conformation polymorp hism analysis , SSCP) 是近年来发展起来的一种基因分析技术。其原理是PCR 扩增产物经变性后可产生两条互补的单链,各单链的碱基序列不同而形成不同的空间构象,如果某一片段(甚至是单个碱基的变化)的碱基序列发生突变或存在多态性,那么其单链的空间构象将发生变化,导致其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的泳动速度发生改变。由于不同构象的DNA片段具有不同的迁移率,因而在凝胶上显现出不同的带型。通过比较带型的差异,得出菌株间的关系。现已广泛用于基因突变和DNA 多态性分析。
王文莉等[12 ] 对氟康唑耐药白色念珠菌分6 段扩增出靶酶基因片段进行SSCP 分析,结果所有受试菌株SSCP 分析均呈阳性结果,其中第6 对引物的扩增片段系突变热点所在部位( 细胞色素P450L1A1 的高可变区) 。另外,耐药株之间也存在差异。将诱变所得耐药菌落与其亲本的带型进行比较,也得到了与上述类似的结果。把此方法用于临床标本的检测,发现不同真菌菌种的DNA 具有可以区分的单链构象多态性,该特征可将白色念珠菌、热带念珠菌和新型隐球菌等医学重要真菌鉴定到菌种[13 ] 。
5 多位点酶电泳
多位点酶电泳(MEE) 方法的基本原理是,将菌细胞中的各种酶通过电泳的方法分开,再对特异的酶进行染色,根据不同菌株中含有的酶的种类不同进行分类。对29 个白色念珠菌分离株的21 种酶进行染色,分离出13 种不同表型的菌株。这种方法的缺点是操作繁琐,通常至少要对10 种以上的酶进行染色,才能进行分类[14 ] 。
6 DNA 序列分析
对两个菌株同一性的判定是基于它们的基因组是否具有相同的DNA 顺序。随着分子生物学技术的发展,核苷酸序列的测定似乎成了现有分子生物学手段的“终结者”。使用测序方法比较两者相同位点的基因序列来鉴别菌株间的差异已成为可能。用该方法对白色念珠菌菌株进行分型,针对白色念珠菌基因组中呈高度多态性的微卫星序列( TTC/TTTC) 作为流行病学标志来鉴别白色念珠菌菌株。作者设计的上游引物为5′-TTTCCTCTTCCTTTCATATAGAA-3′, 下游引物为5′- GGATTCACTAGCAGCAGACA-3′,然后用自动测序仪对PCR 扩增产物进行测序[15 ] 。研究共分析了29 株标准菌株和31 株临床分离菌株,发现共有16 个不同的型别。该方法能有效地用来鉴别菌株,并可用于构建基因组图谱。
7 微卫星多态性分析
微卫星多态性,又称简单序列重复( SSR) ,是指由少数几个(1 个～5 个) 碱基对构成基本单位的短串联重复DNA 序列,如( GA) n 、(AT) n 和( GAA) n等。微卫星标记可用于菌株鉴定分类学研究、宿主与菌株相互关系研究等方面。张军民等[16 ] 利用PCR 技术对31 株白色念珠菌的启动子序列延伸因子3 基因中TTC/ TTTC 微卫星多态性进行分析,检测到9 个等位基因,10 个基因型,其基因型在传代培养中亦稳定,提示该技术重复性好。
长期以来,由于缺乏一种可靠的分型系统对白色念珠菌菌株相关性进行评价,从而无法对白色念珠菌感染进行有效的流行病学调查。一些基于白色念珠菌表型的分型系统缺乏必要的敏感性和重复性,鉴别能力也不高。随着分子生物技术的发展,仅仅依靠其中一种技术已经不够科学,需要几种方法结合起来对白色念珠菌进行基因分型,从而为临床医学工作者提供更加科学准确的理论依据。
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编辑：范伟伟
