摘要：目的 对多重耐药鲍曼不动杆菌进行基因型鉴定。方法 以随机多态核苷酸序列(RAPD)、肠杆菌基因间重复一致序列(ERIC)、基因外重复回文序列(REP)为引物进行PCR扩增，对43株多重耐药鲍曼不动杆菌进行基因分型，应用SPSS 16.0进行聚类分析。结果 三种方法均扩增出丰富的区带，将分离到的43株多重耐药鲍曼不动杆菌分别分为3、4、4个谱型；将43株菌聚为3群，菌问的同源性较近。结论重症监护病房中存在多重耐药鲍曼不动杆菌的感染流行，主要是由同一克隆株在不同科室及感染个体问相互传播所致。
关键词：鲍氏不动杆菌；抗药性，多药；细菌分型技术；聚类分析
鲍曼不动杆菌是重要的条件致病菌，可诱发社区人群获得性感染，也可诱发医院感染，是仅次于铜绿假单胞菌的又一重要非发酵菌。准确的种属鉴定和基因分型对预防和控制多重耐药菌的传播、指导临床感染控制工作特别是传染源和传播途径的追踪具有重要意义。我们采用随机扩增多态性DNA(RAPD)、以基因外重复回文序列(REP)及肠杆菌基因间重复一致序列(ERIC)为模板的重复序列聚合酶链反应(rep-PCR)分型技术对临床重症监护病房分离的多重耐药鲍曼不动杆菌进行基因型鉴定。
1 资料与方法
1.1 临床资料 43株多重耐药的鲍曼不动杆菌分离自我院2009年7～11月重症监护病房送检的非重复性标本，分别为神经内科监护室痰液标本15株、全血标本1株，共16株；血管外科监护室痰液标本8株、全血标本1株，共9株；急诊科监护室痰液标本6株；呼吸科监护室痰液标本5株、尿液标本1株，共6株；普外监护室痰液标本2株；神经外科监护室痰液标本2株；神经外科三病区和急诊一病区痰液标本各1株。其中来自痰液标本40株，血液标本2株和尿液标本1株。
1.2 主要仪器 Veriti PCR扩增仪(美国ABI公司)；DYY-6c 型电泳仪(北京市六一仪器厂)；BOX 凝胶成像系统(基因有限公司)；VITEK-32微生物鉴定系统(生物梅里埃)。
1.3 主要试剂 PCR扩增试剂盒及细菌基因组DNA抽提试剂盒均购自上海生工公司，引物由上海生工公司合成。
1.4 基因分型 细菌总DNA提取按照试剂盒操作说明进行，浓度测定符合标准后进行PCR扩增，参考相关文献，选择引物序列，三种方法引物序列分别为：①RAPD：R3 5’ -GCTTGTGAAC-3’ ；AP4 5’ -AAGAGCCCGT-3’ ；②REP：1R-I 3’ -CGGICTACIGCIGCIIII-5’ ；2-I 5’ -ICGICTTATCIGGCCTAC-3’ ；③ ERIC：1 R 3’ -CACTTAGGGGTCCTCGAATGTA-5’ ；2 5’ -AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’ 。
1.5 扩增方法 ①RAPD扩增体系：采用25 ul 反应体系，循环参数：95℃预变性5 min，95℃ 45 S、36℃ 45 S、72℃ 2 min循环45次，最后72℃延伸10min。②REP-PCR扩增体系：采用25ul 反应体系，循环参数：94 ℃预变性7 min，90℃ 30 S、40℃ 1min、65℃ 8 min循环30次，最后65℃延伸16 min。③ERIC-PCR扩增体系：采用25 ul 反应体系，循环参数：95 ℃预变性5 min，94℃ 1 min、40℃ 1 min、65℃ 8 min循环35次，最后65℃延伸16 min。
1.6 凝胶成像 取8 ul 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶100 V(5 V/cm)电泳60~90 min，凝胶成像系统成像，根据电泳的指纹图谱进行菌株亲缘关系分析，将每个条带转换为二进制数据，“1”代表“有”，“0”代表“无”。
1.7 统计学方法 将所有条带数据输人SPSS 16．0统计学软件，进行Q层次聚类分析。
2 结果
2.1 药敏结果 43株多重耐药鲍曼不动杆菌药敏结果见表1。
2.2 基因分型结果 RAPD、ERIC-PCR与REP-PCR均扩增出清晰丰富的区带，每种方法均扩增两次以上，条带结果稳定。RAPD扩增出6～11个条带，分子量200～3 500 bp，将43株菌分为3个谱型；ERIC-PCR扩增出4~7分条带，分子量200～1 500 bp，将43株菌分为4个谱型；REP-PCR扩增出5～8个条带，分子量200～2 500 bp，将43株菌分为4个谱型。
2.3 聚类分析 按80%的相似性系数，可将43株菌聚为3个类群，群B为24号菌株；群C为30号菌株；群A为其余菌株。A群菌株间的遗传相似水平很高，每一聚类群代表一个基因亚型。A群与B群的亲缘关系较近，同源性接近75% ，而B 群与C 群的亲缘关系相对较远，但同源性也达70%。
3 讨论
鲍曼不动杆菌是革兰阴性杆菌，广泛分布于外界环境，亦常存在于人的皮肤、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中。由鲍曼不动杆菌引发的医院感染可涉及各个部位，引起菌血症、尿道炎和脑膜炎等，尤其是医源性肺炎，在重症监护室常引起医院感染流行甚至暴发。为了明确本院多重耐药鲍曼不动杆菌的流行是否与菌株在不同科室患者间的传播有关，我们采用联合RAPD、ERIC-PCR和REP-PCR方法对43株多重耐药鲍曼不动杆菌进行分型。
RAPD对耐药菌株的流行病学分型方法起着非常重要的作用，具有快速、经济、简便、分辨率高的特点，重复性和分型能力较好。rep-PCR技术是在RAPD基础上发展的对细菌DNA进行指纹图谱分析的方法 ，利用细菌基因组中广泛分布的短重复序列为引物的靶序列PCR扩增，通过对PCR产物电泳结果的比较分析菌株问基因组存在的差异。细菌基因组中分布着广泛的短重复序列，包括常用的REP、ERIC 和BOX，它们在菌株、种、属水平上分布有差异及进化过程有相对保守性。ERIC 和REP两种重复序列是rep-PCR中2个重要的技术。rep-PCR退火温度较高，错配少，重复性和稳定性较好，操作方便费用低，不需要重复设计引物且可广泛应用于多种菌属，可以进行大样本分析。三种技术均可作为耐药菌株追踪溯源的一种有效的技术手段，运用于耐药菌传播疾病发生时对病原菌的追踪，有利于对疾病暴发流行的治疗和控制。为了提高效率，本研究采用三种技术联合的方法进行分析。
本研究对RAPD、ERIC-PCR、REP-PCR指纹图谱及聚类分析结果显示43株来源于不同患者的多重耐药鲍曼不动杆菌间的同源性较近，说明重症监护病房中确实存在多重耐药鲍曼不动杆菌的感染流行，证实了我院耐亚胺培南鲍曼不动杆菌的流行主要是由于同一克隆株在不同科室及感染个体间的相互传播所致，其传染可能与病房环境、医疗器械、医护人员等有关。因此加强控制医院感染至关重要，其中简单有效的方法就是医护人员做好无菌操作、及时发现和隔离感染或定植患者等。
编辑：范伟伟
