美国库尔特公司生产的STKS 全自动五分类血液分析仪,具有测定参数多、分析速度快、结果准确、重复性好、性能相对稳定等特点,但在白细胞分类方面仍存在一些问题。现将我院几年来使用中的体会综合报告如下。
1 分类系统存在的问题
STKS 仪进行白细胞分类是采用VCS 技术,即运用V、C、S 3 种指标,从细胞体积、细胞核特性、颗粒性等方面综合分析白细胞。分类中涉及的Scatterpak 试剂包,内含两种试剂,一种是溶血剂,另一种是稳定剂,同时,以稀释液提供鞘流,令细胞在流式通道内作最合适的单细胞排列,逐个、同时在流式小孔(flow cell) 接受VCS 三重检测。在此分类系统中,造成白细胞不分类或分类异常的原因有以下几方面:
1. 1 试剂温度 虽然操作说明要求温度在17 ℃～29. 5 ℃,但实践证明最佳温度为20 ℃左右 。这是由于在此温度下溶血剂中的表面活性剂能与细胞膜脂质作用,破坏膜的双层脂质结构,使脂质的排列秩序混乱,并深入双层脂质之间和脂质内层,使两层脂质之间距离加大,结构疏松,肿胀,脂质层局部断裂。在细胞膜表面的表面活性剂聚集,形成由密到疏的表面活性剂层,由于其疏水基团较大,为不良导体,加之膜结构疏松肿胀,从而使粒细胞在分析仪上的表现体积变大。当温度升高时,溶血剂中表面活性剂的活性增大,对白细胞作用相对较强,导致细胞表面体积变大更为明显。相反,当温度降低时,白细胞体积会变小,造成细胞分类异常,分类误差较大。因此,操作时,应控制室温在20 ℃左右,冰箱保存的试剂应室温放置20 min 或20 ℃水浴10 min 方可使用。
1. 2 溶血剂与稳定剂的配比 由于溶血剂先参与溶解红细胞和血小板,此时白细胞发生肿胀,随后加入稳定剂使白细胞恢复等渗、生理pH ,使细胞接近原态,然后通过流式通道。血液、溶血剂、稳定剂三者之比为28∶600∶133 ,如果该比例失衡,则导致:溶血不充分,大量红细胞通过流式通道,仪器无从辨别,从而不分类;稳定剂不充分导致白细胞不能完全恢复常态,通过流式小孔的有效颗粒不够8192 个,从而不分类。这种情况可通过调节液流比例相应参数加以纠正。
1. 3 鞘液及样本压力不够 当负压管路提供的鞘液及样本进样压力不够时,会影响样本和鞘液的进样量,同样会导致不分类或分类异常。
1. 4 流式小孔光路或管路的污染 流式小孔外面为极细的石英管,很小的血凝块就会挡住激光光路,因此,小孔外的罩板应保证密封。如发生堵孔,可用少许洁净脱脂棉条沾分析纯无水酒精擦拭光柱两侧。注意:切不可擦拭光路底座,另外,由于小孔及下面的通液硅胶管极细,同样易堵,可用100g/L 的次氯酸钠或仪器的清洁液反复冲洗。硅胶管拆卸时可用镊子,手法宜轻柔。混匀池的污染同样是造成小孔堵塞的隐患,此时,可将混匀池更换即可。
2 进样管路存在的问题
进样管路的污染或堵孔是造成分类或计数故障的最常见的原因,堵孔会直接影响通过流式小孔分类的细胞数,从而导致有效颗粒数量不够,造成不吸样或部分吸样。处理此类问题不外乎管道的机械清洁和手工清洁。其原因可从以下几个途径考虑:
2. 1 真空采血管不合格 我们曾遇到标本出现部分吸样率较高的情况,反复检测,仪器未发现任何故障,经仔细观察,发现是真空采血管上的橡胶帽过长导致进样针不能完全穿透采血管,及时更换合格采血管后,问题得以解决。
2. 2 进样针、吸样阀的分血片堵孔 进样针堵塞时,可依照操作说明将进样针卸掉,用微细钢丝(可采用废弃的针灸针)把凝块捅出,然后用注射器吸取蒸馏水冲洗即可;分血片堵塞时,可先执行冲洗,如不能解决问题,应按照操作说明冲洗分血片。
2. 3 负压泵负压不够,气路管道漏气、堵塞 负压泵及负压调节阀应在工作中密切监视,一旦超出警戒值,应及时调节至规定阈值范围内。若为气路管道的原因,可打开前盖仔细观察,较大漏气可听到咝咝声,找到管路,更换备用管即可。气路的堵塞一般只出现在固有的几个排气阀门,此时,将螺帽拧掉用洗耳球轻吹便可排除。
3 标本本身的问题
3. 1 病理因素导致的细胞分类异常 一些病理因素如高龄孕妇(存在有核红细胞) 、冷球蛋白血症、重症肝炎、高脂血症、粒细胞白血病、血友病等,均可造成细胞计数误差或分类异常。如冷球蛋白血症病人,由于存在冷球蛋白的干扰,标本需在37 ℃预温10 min ,待聚集的细胞离散后方可进行检测。重症肝炎病人,由于患者血液中红细胞脆性变小,红细胞不易破坏,仪器检测时会把未破坏的红细胞计数为白细胞,影响结果的准确性。这些都是五分类血液分析仪未能克服的问题,这种情况下,结果一般会报“review slide”或“blast”或“viarant lymphocyte”等,此时,复片检查,会发现问题及时进行手工镜检。
3. 2 静脉采血、抗凝剂比例 静脉采血目前使用一次性真空负压采血管,应注意采血速度不宜过快,避免造成溶血。注入试管时,应利用管内的负压吸入血样,颠倒混匀。一般2ml 的采血管,允许误差在±0. 5 ml 。血量过多或过少都会对结果造成影响,血量过多,抗凝不充分,会出现血凝块;血量过少,会导致抗凝剂过浓。由于血细胞遇抗凝剂先有一个短暂的(1～2 min) 收缩过程,这是因为钾离子加入血浆后,改变了渗透压,导致水从细胞内流出所致。随后,细胞将钾离子泵进膜内,细胞又恢复原态。绝大部分患者的标本这一过程只需几分钟,但也有人需要20～30 min。抗凝剂过浓会延长这个平衡时间。如果在收缩状态下检测,V 减小,S 减小,细胞分类将受到影响。这就要求或者采血后在细胞收缩前马上检测,或者放置20～30 min 后再进行检测。
3. 3 标本放置时间过长(3～4 h 以上) 放置时间过长会导致细胞分层,分层的细胞会产生不同的代谢物,形成微环境,此时,白细胞体积与其周围的微环境相适应,重新混匀后需重新建立平衡,最初的1～2 min 收缩,达到平衡约需30 min。这一现象对血脂较高的标本影响更为明显,V 和S 大幅度减小,达到平衡所需的时间更长。对此,可对静置的标本进行间隔性混匀,或在放置后混匀,等30 min 再测。
3. 4 低能量白细胞(衰老、温度影响、或生理异常) 这类细胞与scatterpak 反应后,由于离子泵慢或根本无力,不能很快从肿胀状态恢复到原态,比起新鲜标本,其V 变大,S 减小。有人报道把低能量白细胞放到冰箱一段时间再测,会得到一张正常的分布图。
综上所述,五分类血液分析仪在细胞分类方面还存在着一定的问题,据统计库尔特STKS 血液分析仪与人工分类的符合率为70 %左右 ,因而,对于结果中任何的异常,都应该进行手工复片。
编辑：范伟伟
