摘要：目的 应用聚合酶链反应技术扩增特异DNA片段，并制备成为可应用于临床鉴定白色念珠菌的基因探针。方法 采用聚合酶链反应技术特异地扩增白色念珠菌标准株DNA EO3 125 bp基因片段，然后用半抗原地高辛配基标记，在完成基因探针显色敏感度检测之后，应用该基因探针分别对血液病病房分离的白色念珠菌、热带念珠菌及大肠埃希菌等多种细菌进行斑点杂交测试。结果基因扩增制备Dig-125 bp DNA探针显色敏感度为0．01 Pg，具有白色念珠菌特异性，与其他念珠菌和细菌不发生杂交。结论 基因扩增制备EO3 125 bp DNA探针方法简便可靠，具有很强特异性，可应用于临床鉴定白色念珠菌感染。
关键词：DNA扩增；探针；白色念珠菌；杂交
随着免疫抑制剂、广谱抗生素、抗肿瘤药物的应用及各种器官移植和导管应用，临床真菌感染趋势发展迅速，真菌感染已成为血液病房第1病原菌和主要致死因素，而念珠菌是最常见条件致病真菌，其中白色念珠菌致病性最强、感染率最高。因此在临床上建立快速和准确念珠菌感染鉴定技术具有重要临床应用价值。本研究首次应用基因扩增技术制备白色念珠菌EO3 125 bp DNA探针，并应用于临床鉴定白色念珠菌感染取得良好效果，现予以介绍。
1 材料与方法
1．1 菌株 白色念珠菌标准株10231购自中国军事医学科学院，热带念珠菌和近平滑念珠菌标准株购自中国医科院皮肤病研究所，临床分离白色念珠菌23株，大肠埃希菌、痢疾志贺菌、伤寒杆菌、肠球菌属、幽门螺杆菌各1株。
1．2 主要试剂 溶细胞酶(lyticase，Sigma公司)、蛋白酶K(华美生物工程公司)、地高辛配基(digoxi-genin)标记试剂盒(Boehringer Mannheim 公司)、Taq DNA 聚合酶(Promega公司)、EO3 扩增引物由本所392—05型DNA合成仪(美国ABI公司生产)
合成。
1．3 主要仪器 美国PE公司9600型DNA扩增仪，美国ABI公司395—05型DNA合成仪，DYY—III 稳压稳流电泳仪及DYY—III 电泳槽、微型水平电泳槽、TGL-16G高速台式离心机、ZF-3型紫外透射反射分析仪等。
1．4 DNA提取 细菌DNA的提取。临床标本处理及念珠菌DNA的提取。
1．4．1 咽拭子处理 咽拭子扦入0．3ml 破壁液中(50mmol／L Tris PH7．5，10mmol／L EDTA，1% β-琉基乙醇)。加20ul溶细胞酶(3mg/m1)，30℃作用1 h。加SDS(终浓度1% )，蛋白酶K(终浓度25 ug／ml )56℃作用1 h， 用等体积苯酚／氯仿，氯
仿／异戊醇各抽提1次，上清加1／10 体积3M KAC 及2．5倍体积无水乙醇，-20℃过夜。9 000 r／min离心，沉淀物用70% 乙醇洗2次，自然干燥后加10ul TE溶解。
1．4．2 血标本处理 血细胞DNA清除0．5 ml 血液加等体积TTNT(1% 吐温—20，1％TritonX—100，1% NP40，0．05 mol／L Tris，PH7．5)混匀，9 000 r／rain离心15min，弃上清。重复1次。沉淀物用0．05 mol／L，Tris—HCL(pH7．5)，0．01 mol/L MgCl2洗2次，沉淀悬于0．5 ml 该洗涤液中，加DNase I 5U，37℃ 作用10 min。加EDTA(0．01 mol/L)，80℃ 作用30 min，离心弃上清，余处理方法同咽拭子处理。
1．5 白色忿珠酋基因探针的制备
1．5．1 白色念珠菌EO3-125 bp DNA 扩增 在EO3 基因内设计一对特异性引物，其引物序列为：5’— CACCAACTCGACCAGTAGGC—3’ (引物1)，5’—CGGGTGGTCTATATTGAGAT—3’ (引物2)，扩增片段长度为125bp，模板为提取的白色念珠菌DNA，PCR 反应系统为：总反应体积25u1，TaqDNA聚合酶1．25U，80mM KCL，1．5 mM MgCL，10mM Tris-HCL(pH 8．0)， 0．1 NaCl，0．1 Triton X-100，各50uM dNTP，250pg DNA模版，0．1uM 引物1和引物2 循环参数为先将模板
DNA预变性97℃ ，5 min，冷却后加入上述反应体系中Taq DNA聚合酶，进行三温循环，94℃ 30 s，56℃ 60 s，72℃ 90 s，35次循环。
1．5．2 PCR产物纯化 将上述扩增的DNA总体积300ul，经苯酚／氯仿抽提纯化，无水乙醇沉淀，-20℃过夜。12 000/min离心15min，DNA溶于10 ul 水中。
1．5．3 125bp DNA的标记 用地高辛配基以随机寡核苷酸引物法标记DNA，参照试剂盒说明书进行，标记后的探针溶于20 ul TE中(约含0．4ug探针)-20℃保存。
1．6 探针敏感性检测 取探针少量，进行逐级稀释，吸2 ul 点于硝酸纤维索膜上，Dig-125bp DNA在膜上每点浓度分别为100、10、1、0.1、0．01pg，经抗Dig—Ap作用，均以底物BICP-NBT显色，以检测探针的显色敏感度。
1．7 斑点杂交试验 提取的念珠菌及细菌DNA，经热变性处理后(95℃10min，冰浴5min)，取3 ul 点于硝酸纤维索膜，80℃ 烤膜1～1.5h 进行杂交试验，Dig-125bp DNA杂交液探针浓度为20 ug／ml，杂交温度42℃。洗膜后用抗Dig—AP作用后，以底物BICP-NBT显色。
2 结果
2．1 探针教感性鉴定 Dig-125bp基因探针显色敏感度为0．01pg见图1。
2．2 斑点杂交试验结果 Dig-125bpDNA探针与白色念珠菌标准菌株及临床分离23株野生株杂交结果阳性，与热带念珠菌和近平滑念珠菌以及大肠埃希苗等细菌无杂交信号，表明该探针具有高度特异性，见图2。
3 讨论
念珠菌属(Candida)是人类最常见条件致病菌，可引起人类皮肤粘膜至内脏各系统的感染，近20年来，随着广谱抗生索、皮质类固醇激素、及免疫抑制剂的广泛应用和放射医学的不断发展。病原菌和宿主间的关系不断发生变化，体内环境平衡紊乱、菌群失调，致使真菌感染日益增多，尤以念珠菌病发病率最高 ，而内生性念珠菌病诊断又是临床上的难题，目前，真菌鉴定分类所用的表型生物学方法程序繁琐，结果重复性差，放射免疫及酶联免疫诊断也只是取得了部分的成功。因而使念珠菌病的防治进展受到一定限制，人们开始制备念珠菌基因探针，应用基因探针从基因水平上鉴定念珠菌是一种快速、简便、特异的方法，已经发现的用于鉴别临床上念珠菌的特异性片段有两个，一是Mason等发现的用白色念珠菌肌动蛋白基因片段作为探针来鉴定临床上常见的7种念珠菌的存在，另一个是Cutler 等报道的一个白色念珠菌DNA的2．9Kb片段，此片段经标记后只与白色念珠菌和类星形念珠菌杂交，而与其他真菌、小鼠和人体细胞不杂交，很可能被作为探针鉴定白色念珠菌的存在。周颂等合成27 nt 的寡核苷酸作为探针筛选白色念球菌新的MAPK。另外，Scherer 等报道从白色念珠菌基因组中，分离出了一个重要的DNA部分，并被作为种特异的探针来区分同一医院中不同患者身上的相关的不同菌株，还可用于白色念珠菌家旗DNA多样性分析。但这些都是用酶切回收特异片段DNA方法制备探针，方法比较繁杂，较难对染色体DNA进行限制性内切酶的完全酶切，以至不能保证回收DNA片段的纯度，提取标准白色念珠菌DNA纯度要求高、产量比较低，从而影响探针的特异性，国内李春阳等用EcoRI 对白色念珠菌标准株做酶切分析，得到2．5Kb片段，经32P标记后分别与各种念珠菌、隐球菌、细菌进行核酸杂交，显示片段与白色念珠菌杂交强阳性，与近平滑和热带念珠菌出现微弱杂交信号。陈曦等发现多种白色念珠菌中都有CX 20．5Kb重复序列，证实该序列与白色念珠菌变形有关。
本实验按照《分子克隆》等介绍的实验方法·应用聚合酶链反应技术制备白色念珠菌基因探针，这种方法最显著优点，在于它可以快速地生成独特系列的探针，避免了常规制备探针方法要先对特异片段进行克隆，后进行酶切、回收、然后才标记的繁杂过程，使探针制备太大简化，所需时间显著缩短，大多数情况下，这种探针具有足够的长度，使杂交能在常规条件下进行，另一处优点即是特异性强，本研究用白色念珠菌特异EO3 基因中的125bp DNA扩增产物，经半抗原-Dig标记后作探针其显色敏感度高达0．01pg，斑点杂交结果表明，该探针具有高度特异性，它仅与白色念珠菌杂交，不和热带念珠菌、幽门螺杆菌、大肠埃希菌等其他菌等交叉，与国内李氏制备的2．5kb DNA，经32P标记的探针比较特异性更强，该探针制备可望为临床念珠菌鉴定分类提供有效可靠的手段，特别是将探针杂交和PCR技术相结合，更能提高诊断的准确性和敏感性，拓展了PCR技术的应用范围，而且还能进一步印证PCR所扩增产物的特异性。
编辑：范伟伟
